Взаимодействие RANKL / RANK также способствует экспрессии других остеокластогенных факторов, таких как NFATc1 и DC-STAMP. Взаимодействуя с факторами транскрипции PU.1, cFos и MITF, NFATc1 регулирует гены, специфичные для остеокластов, включая TRAP и катепсин K , которые имеют решающее значение для активности остеокластов [90]. Под влиянием взаимодействия RANKL / RANK NFATc1 также индуцирует экспрессию DC-STAMP, которая имеет решающее значение для слияния предшественников остеокластов [91, 92].

Несмотря на то, что эти остеокластогенные факторы были хорошо определены, недавно было продемонстрировано, что остеокластогенный потенциал может различаться в зависимости от рассматриваемого участка кости. Сообщалось, что остеокласты из длинного костного мозга формируются быстрее, чем в челюсти. Эта различная динамика остеокластогенеза, возможно, может быть связана с клеточным составом костного мозга, специфичным для костной ткани [93].

Во время ремоделирования кости остеокласты поляризуются; затем можно наблюдать четыре типа мембранных доменов остеокластов: зону уплотнения и волнистую границу, которые находятся в контакте с костным матриксом (рис. 4 (b) и 4 (d)), а также базолатеральный и функциональный секреторные домены, которые не контактируют с костным матриксом [94, 95].Поляризация остеокластов во время резорбции кости включает перестройку актинового цитоскелета, в которой образуется кольцо F-актина, которое включает плотную непрерывную зону высокодинамичной подосомы, и, следовательно, область мембраны, которая развивается в взъерошенную границу, изолирована. Важно отметить, что эти домены образуются только тогда, когда остеокласты находятся в контакте с внеклеточным минерализованным матриксом, в процессе, в котором -интегрин, так же как и CD44, опосредует прикрепление подосом остеокластов к поверхности кости [96-99] .Ультраструктурно волнистая граница представляет собой мембранный домен, образованный микроворсинками, который изолирован от окружающей ткани прозрачной зоной, также известной как зона уплотнения. Светлая зона — это область, лишенная органелл, расположенная на периферии остеокласта рядом с костным матриксом [98]. Эта запечатывающая зона образована актиновым кольцом и несколькими другими белками, включая актин, талин, винкулин, паксиллин, тензин и связанные с актином белки, такие как α -актинин, фимбрин, гельсолин и динамин [95].-Интегрин связывается с неколлагеновым костным матриксом, содержащим -RGD-последовательность, такую ​​как костный сиалопротеин, остеопонтин и витронектин, создавая периферическое уплотнение, ограничивающее центральную область, где расположена взъерошенная граница [98] (рисунки 4 (b) -4 ( г)).

Поддержание взъерошенной границы также важно для активности остеокластов; эта структура формируется за счет интенсивного перемещения лизосомальных и эндосомальных компонентов. В взъерошенной кайме находится H ⁺ -АТФаза вакуольного типа (V-АТФаза), которая помогает подкислять лакуну резорбции и, следовательно, способствует растворению кристаллов гидроксиапатита [20, 100, 101].В этой области протоны и ферменты, такие как устойчивая к тартрату кислотная фосфатаза (TRAP), катепсин K и матриксная металлопротеиназа-9 (MMP-9), транспортируются в отсек, называемый лакуной Howship, что приводит к деградации кости [94, 101–104 ] (Рисунок 5). Продукты этой деградации затем подвергаются эндоцитозу через взъерошенную границу и транслируются в функциональный секреторный домен на плазматической мембране [7, 95].

Аномальное увеличение образования и активности остеокластов приводит к некоторым заболеваниям костей, таким как остеопороз, когда резорбция превышает образование, вызывая снижение плотности костей и увеличение числа переломов костей [105].При некоторых патологических состояниях, включая метастазы в кости и воспалительный артрит, аномальная активация остеокластов приводит к околосуставным эрозиям и болезненным остеолитическим повреждениям соответственно [83, 105, 106]. При пародонтите заболевание пародонта, вызванное размножением бактерий [107, 108], вызывает миграцию воспалительных клеток. Эти клетки продуцируют химические медиаторы, такие как IL-6 и RANKL, которые стимулируют миграцию остеокластов [89, 109, 110]. В результате в альвеолярной кости происходит аномальное усиление резорбции костной ткани, что способствует потере прикрепления зубов и прогрессированию пародонтита [89, 111].

С другой стороны, при остеопетрозе, который является редким заболеванием костей, генетические мутации, которые влияют на функции образования и резорбции в остеокластах, приводят к снижению резорбции кости, что приводит к непропорциональному накоплению костной массы [17]. Эти заболевания демонстрируют важность нормального процесса ремоделирования кости для поддержания гомеостаза кости.

Кроме того, есть свидетельства того, что остеокласты выполняют несколько других функций. Например, было показано, что остеокласты продуцируют факторы, называемые кластокинами, которые контролируют остеобласты во время цикла ремоделирования кости, который будет обсуждаться ниже.Другое недавнее доказательство состоит в том, что остеокласты также могут напрямую регулировать нишу гемопоэтических стволовых клеток [112]. Эти данные показывают, что остеокласты являются не только клетками, резорбирующими кости, но также источником цитокинов, которые влияют на активность других клеток.

2.5. Внеклеточный костный матрикс

Кость состоит из неорганических солей и органического матрикса [113]. Органический матрикс содержит коллагеновые белки (90%), преимущественно коллаген I типа и неколлагеновые белки, включая остеокальцин, остеонектин, остеопонтин, фибронектин и костный сиалопротеин II, костные морфогенетические белки (BMP) и факторы роста [114].Существуют также небольшие протеогликаны, богатые лейцином, включая декорин, бигликан, люмикан, остеодерин и сериновые белки [114–116].

Неорганический материал кости состоит преимущественно из ионов фосфата и кальция; однако также присутствуют значительные количества бикарбоната, натрия, калия, цитрата, магния, карбоната, флюорита, цинка, бария и стронция [1, 2]. Ионы кальция и фосфата образуют зародыши с образованием кристаллов гидроксиапатита, которые представлены химической формулой Ca ₁₀ (PO ₄ ) ₆ (OH) ₂ .Вместе с коллагеном неколлагеновые матричные белки образуют каркас для отложения гидроксиапатита, и такая ассоциация отвечает за типичную жесткость и сопротивление костной ткани [4].

Костный матрикс представляет собой сложный и организованный каркас, который обеспечивает механическую поддержку и играет важную роль в гомеостазе кости. Костный матрикс может высвобождать несколько молекул, которые мешают активности костных клеток и, следовательно, участвует в ремоделировании кости [117].Поскольку одной потери костной массы недостаточно, чтобы вызвать переломы костей [118], предполагается, что другие факторы, включая изменения белков костного матрикса и их модификации, имеют решающее значение для понимания и прогнозирования переломов костей [119]. Фактически, известно, что коллаген играет решающую роль в структуре и функции костной ткани [120].

Соответственно, было продемонстрировано, что существует вариация в концентрации белков костного матрикса с возрастом, питанием, заболеванием и антиостеопоротическим лечением [119, 121, 122], что может способствовать деформации после растяжения и переломам кости [119] .Например, исследования in vivo, и in vitro, показали, что увеличение синтеза гиалуроновой кислоты после лечения паратироидным гормоном (ПТГ) было связано с последующей резорбцией кости [123–127], что указывает на возможную связь между синтезом гиалуроновой кислоты и повышение активности остеокластов.

2.6. Взаимодействие между костными клетками и костным матриксом

Как обсуждалось ранее, костный матрикс не только обеспечивает поддержку костных клеток, но также играет ключевую роль в регулировании активности костных клеток посредством нескольких молекул адгезии [117, 128].Интегрины являются наиболее распространенными молекулами адгезии, участвующими во взаимодействии между костными клетками и костным матриксом [129]. Остеобласты взаимодействуют с костным матриксом с помощью интегринов, которые распознают и связываются с RGD и другими последовательностями, присутствующими в белках костного матрикса, включая остеопонтин, фибронектин, коллаген, остеопонтин и костный сиалопротеин [130, 131]. Наиболее распространенными интегринами, присутствующими в остеобластах, являются, и [132]. Эти белки также играют важную роль в организации остеобластов на поверхности кости во время синтеза остеоидов [129].

С другой стороны, взаимодействие между остеокластами и костным матриксом важно для функции остеокластов, поскольку, как упоминалось ранее, резорбция кости происходит только тогда, когда остеокласты связываются с минерализованной поверхностью кости [97]. Таким образом, во время резорбции костной ткани остеокласты экспрессируют интегрины и взаимодействуют с внеклеточным матриксом, в котором первый связывается с обогащенными костями RGD-содержащими белками, такими как костный сиалопротеин и остеопонтин, тогда как интегрины связываются с фибриллами коллагена [133, 134].Несмотря на эти связывания, остеокласты обладают высокой подвижностью, даже при активной резорбции, и, как мигрирующие клетки, остеокласты не экспрессируют кадгерины. Однако было продемонстрировано, что кадгерины обеспечивают тесный контакт между предшественниками остеокластов и стромальными клетками, которые экспрессируют важные факторы роста для дифференцировки остеокластов [135].

Интегрины играют посредническую роль во взаимодействиях остеоцитов с костным матриксом. Эти взаимодействия необходимы для механочувствительной функции этих клеток, посредством чего сигналы, индуцированные деформацией ткани, генерируются и усиливаются [136].До сих пор неясно, какие интегрины участвуют, но было высказано предположение, что интегрины и интегрины участвуют во взаимодействии остеоцитов с костным матриксом [137, 138]. Эти взаимодействия происходят между телом остеоцитов и костным матриксом стенки лакуны, а также между стенкой канальца с отростками остеоцитов [137].

Только узкое перицеллюлярное пространство, заполненное жидкостью, отделяет тело клетки остеоцита и отростки от минерализованного костного матрикса [58]. Расстояние между телом клетки остеоцита и лакунарной стенкой составляет примерно 0.5–1,0 мкм м шириной, тогда как расстояние между мембранами отростков остеоцитов и стенкой канальцев колеблется от 50 до 100 нм [139]. Химический состав перицеллюлярной жидкости точно не определен. Однако присутствует разнообразный набор макромолекул, продуцируемых остеоцитами, таких как остеопонтин, остеокальцин, белок матрикса дентина, протеогликаны и гиалуроновая кислота [136, 140, 141].

Остеоциты и их отростки окружены неорганизованным перицеллюлярным матриксом; внутри канальцевой сети наблюдались тонкие фиброзные связи, названные «тросами» [139].Было высказано предположение, что возможным соединением этих связок является перлекан [141]. Отростки остеоцитов также могут прикрепляться непосредственно к «бугоркам», которые представляют собой выступающие структуры, исходящие из стенок канальцев. Эти структуры образуют тесные контакты, возможно, посредством -интегринов, с мембраной отростков остеоцитов [137, 142]. Таким образом, эти структуры, по-видимому, играют ключевую роль в механочувствительной функции остеоцитов, воспринимая движения потока жидкости вместе с перицеллюлярным пространством, вызванные силами механической нагрузки [143].Кроме того, движение потока жидкости также важно для двунаправленного транспорта растворенных веществ в перицеллюлярном пространстве, который влияет на сигнальные пути остеоцитов и связь между костными клетками [144, 145].

2.7. Местные и системные факторы, регулирующие гомеостаз кости

Ремоделирование кости — это очень сложный цикл, который достигается согласованными действиями остеобластов, остеоцитов, остеокластов и клеток выстилки кости [3]. Образование, пролиферация, дифференцировка и активность этих клеток контролируются местными и системными факторами [18, 19].К местным факторам относятся аутокринные и паракринные молекулы, такие как факторы роста, цитокины и простагландины, продуцируемые костными клетками, помимо факторов костного матрикса, которые высвобождаются во время резорбции кости [46, 146]. Системные факторы, которые важны для поддержания гомеостаза костей, включают паратироидный гормон (ПТГ), кальцитонин, 1,25-дигидроксивитамин D ₃ (кальцитриол), глюкокортикоиды, андрогены и эстрогены

Методы клеточной биологии

Хотя C.elegans в первую очередь преподносится за его легкую генетику, растет интерес к изучению биологических процессов клетки в этот организм. Сильная генетика (Brenner, 1974; Jorgensen and Mango, 2002), разработка флуоресцентных белковых меток (Chalfie et al., 1994; Yang et al., 1996; Zhang et al., 2004), доступность стратегий интерференции РНК для нарушают функцию генов (Fire et al., 1998; Timmons and Fire, 1998), а также возможность проводить исследования на первичных культурах эмбриональных клеток (Christensen et al., 2002; Zhang et al., 2002), все они привели к увеличению числа биологических проблем клетки, решаемых с помощью червя. Кроме того, прозрачность организма дает уникальную возможность изучить роль клеточных биологических процессов у живого многоклеточного животного.

Серьезным препятствием для изучения биологических явлений клетки C. elegans является небольшой размер его клеток. Однако достижения в области методов визуализации позволили значительно усилить слабые сигналы. и небольшие конструкции для визуализации, позволяющие исследовать процессы транспортировки, экспорта и импорта, а также структуры цитоскелета и хроматина.

Здесь мы собрали набор протоколов, которые в целом подходят под категорию клеточной биологии. Начнем с краткого обсуждения различных микроскопических методов, используемых исследователями C. elegans, для изучения различных аспектов клетки. Затем мы описываем методы изучения взаимодействий белок-белок и белок-ДНК. в C. elegans . Мы также описываем методы, используемые для изучения конкретных биологических проблем клетки (например,эндоцитоз, хроматин, запрограммированная гибель клеток). Наконец, мы завершаем эту главу обсуждением первичной культуры эмбриональных клеток и ее использования.

Авторы разделов или протоколов указаны в скобках после заголовков разделов или протоколов. В некоторых случаях, Протоколы основаны на ранее опубликованных работах, которые затем цитируются после названия протокола. Он-лайн формат этого Глава должна легко допускать изменения и дополнения к представленным здесь протоколам.Исследователи готовы поделиться протоколами не представленные здесь или с комментариями к существующим протоколам, рекомендуется отправлять их по адресу [email protected].

2. Визуализация ячеек и их компонентов.

Чтобы изучать предметы, мы должны взаимодействовать с ними. Как правило, техника взаимодействия определяется размером объекта.Таким образом, объект макроскопических размеров можно изучать путем прямого контакта. Однако микроскопические объекты, такие как клетка и ее органеллы необходимо изучать с помощью агентов аналогичного или меньшего размера. Клетки в C. elegans имеют диаметр примерно 3–30 микрон, поэтому свет с длиной волны в видимом диапазоне (~ 500 нм) является идеальным взаимодействующим веществом. агент. Установка световых микроскопов обеспечивает разрешение, составляющее примерно половину длины волны используемого света.Таким образом, свет микроскопия полезна для изучения клеток и клеточных субструктур размером порядка 200–300 нм и более. Однако везикулы (часто диаметром 50 нм) и другие объекты аналогичного или меньшего масштаба не могут быть разрешены с использованием текущих настроек. Несмотря на то что, в принципе, свет с очень короткой длиной волны (например, рентгеновские лучи) может использоваться для разрешения более мелких клеточных структур, таких как свет слишком энергичен, при контакте повреждает клетку. Кроме того, линз для фокусировки фотонов высоких энергий не существует.Высокое разрешение можно получить с помощью электронной микроскопии. Движущиеся электроны в электронном микроскопе обладают длинами волн порядка 0,3 нм. С помощью электронного микроскопа электроны можно использовать для формирования четких изображений клеточных структур размером около 3 нм размером.

2.1. Дифференциально-интерференционная контрастная (ДИК или микроскопия Номарского)

Видимый свет можно использовать для исследования C.elegans , однако, в целом светлопольная и фазово-контрастная микроскопия предлагает мало контрастирующих клеток и их основных компонентов. трудно увидеть. Однако ДИК-микроскопия позволяет формировать высококонтрастные изображения и идеально подходит для исследования ядер, ядрышек, и гранулярные структуры внутри клеток C. elegans (Sulston and Horvitz, 1977; Sulston et al., 1983). В ДИК-микроскопии свет проходит через плоский поляризатор. Полученный поляризованный свет разделяется на две составляющие с помощью призма.Эти компоненты взаимодействуют с образцом и объединяются над объективом с помощью второй призмы. Наконец, проходящий свет проходит через анализатор (по сути, поляризатор, поляризованный под углом 90 градусов по отношению к исходная плоскость поляризации) и далее к наблюдателю. Взаимодействие поляризованного света с образцом меняет его плоскость. поляризации. Таким образом, наблюдателем будет обнаружен только свет, поляризация которого изменена образцом.Таким образом, образуются сильно контрастирующие изображения. Следует помнить, что эффекты затенения, наблюдаемые при использовании ДИК-микроскопии, не отражают трехмерных характеристик образца. Скорее, они отражают способность образца взаимодействовать с поляризованными легкий. Современные микроскопы позволяют использовать 100-кратный объектив с ДИК, что обеспечивает высокое увеличение и разрешение. Некоторые микроскопы оснащены дополнительными линзами, однако они не дают лучшего разрешения.

Протокол установки C. elegans для наблюдения с использованием DIC микроскопии представлен ниже. Этот протокол можно использовать для установки животных для всех микроскопических методов. используя составной микроскоп.

2.2. Микроскопия в поляризованном свете (Дениз Флаэрти и Гай Бениан)

Поляризованный свет можно использовать для исследования повторяющихся или кристаллических структур.Подобно ДИК, плоскополяризованный свет который проходит через образец, будет взаимодействовать с образцом и изменять его плоскость поляризации, позволяя свету детектируется с помощью анализатора, расположенного над образцом и ориентированного под углом 90 градусов к начальной плоскости поляризации (для более полное описание см. http://www.microscopyu.com/articles/polarized/ polarizedintro.html).

Мышцы, используемые для передвижения в C.elegans находятся в стенке корпуса. У взрослого человека имеется 95 веретеновидных клеток, разделенных на четыре квадранта прямо под фундаментом. мембрана, гиподерма и кутикула. В каждом квадранте ячейки расположены во взаимосвязанных парах. В этих мышечных клетках миофиламенты образуют решетку, которая ограничена узкой зоной ~ 1,5 микрон, непосредственно под базальной мембраной и гиподермой. При микроскопии в поляризованном свете видны очевидные полосы; яркие («двулучепреломляющие») А-полосы чередуются с темными I-полосами; каждый I-полоса содержит ряд плотных тел, которые являются аналогами Z-дисков поперечно-полосатой мышцы позвоночных (рис. 2).Поскольку бороздки расположены под слегка наклонным углом по отношению к длинной оси червя, эта мышца называется «Косо-исчерченный». Поляризованный свет также полезен для оценки второго по величине набора мускулов — глотки. Ниже мы представляем протокол наблюдения за мышцами C. elegans с использованием поляризованного света.

2.3. Флуоресцентная микроскопия.

Клеточные структуры и компоненты могут быть помечены различными флуоресцентными красителями, которые можно визуализировать с помощью флуоресценции. микроскоп. В ответ на падающий свет определенной длины волны (создаваемый лазером или с использованием соответствующих фильтров) флуоресцентный молекулы красителя возбуждены.При распаде молекулы из возбужденного состояния в промежуточное возбужденное состояние образуется фотон с длиной волны больше, чем у источника возбуждения, которую можно легко обнаружить и отделить с помощью соответствующих фильтров, от падающего света (более подробное описание см. на http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html). Ниже приведен ряд протоколов использования красителей для визуализации ДНК, белков и клеточных структур.Красители, связанные с антителами особенно полезны для визуализации присутствия и локализации определенных белков внутри клетки, и несколько методов для окрашивания антител обсуждаются в главе об экспрессии генов. Часто представляет интерес изучить, действительно ли две клеточные молекулы физически взаимодействуют. Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) использовался для указания близости двух меченые флуорофоры.Однако до настоящего времени этот метод не применялся в C. elegans .

2.3.1.1. Визуализация ДНК

Ряд флуоресцентных красителей можно использовать для визуализации ДНК у фиксированных животных. 4 ‘, 6’-диамидино-2-фенилиндол гидрохлорид (DAPI), является наиболее часто используемым красителем ДНК в C.elegans (рис. 3).

2.3.1.2. Маркировка экспонированных нейронов красителями

Амфидные и фазмидные нейроны могут поглощать липофильные красители из окружающей среды (Hedgecock et al., 1985; Perkins et al., 1986). Эти красители будут маркировать все части нейрона. Механизм поглощения красителя неясен, но, кажется, коррелирует с некоторыми аспект нейрональной функции. Таким образом, эти красители можно использовать для визуализации нейронов и, возможно, для изучения их физиологии (рис. 4). Краситель флуоресцеина изотиоцианат (FITC) может использоваться для мечения клеток ADF, ASH, ASI, ASJ, ASK и ADL амфид. сенсиллы и нейроны PHA и PHB фазмидной сенсиллы.DiI, DiO и DiD (молекулярные зонды) можно использовать для визуализации нейроны амфиды ASI, ADL, ASK, AWB, ASH и ASJ, а также фазмидные нейроны PHA и PHB (Collet et al., 1998).

2.3.1.3. Визуализация актина

Нитчатый актин можно легко наблюдать у C.elegans путем окрашивания конъюгированным с флуоресцином фаллоидином (Strome, 1986). С помощью этого метода также можно визуализировать другие структуры актина, однако следует использовать протокол 7, приведенный ниже.

2.3.2. Флуоресцентные белки

Использование флуоресцентных белков для маркировки клеточных белков произвело революцию в клеточной биологии (Zhang et al., 2002). В C. elegans зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его производные, а недавно и DsRed, были использованы для визуализации локализации белка, движение и конформационные изменения in vivo (Chalfie et al., 1994; Miyawaki, 2002). Слияние с любым белком может быть произведено с использованием наборов векторов, созданных Энди Файром и другими (Miller et al., 1999). Кроме того, мечение конкретных органелл может быть выполнено с использованием предварительно созданных векторов, содержащих GFP, слитый со специфическими субклеточные нацеленные последовательности.Часто используемые сигналы локализации включают сигналы ядра, митохондрий, и плазматическая мембрана. Подробности относительно флуоресцентных белков можно найти в главе об экспрессии генов.

2.3.3. Флуоресцентно-меченые антитела

Изучение локализации белка с помощью слитых белков GFP или DsRed требует инъекции соответствующих трансгенов животным.Таким образом, существует ряд предостережений при интерпретации результатов таких экспериментов. Например, экспрессия из массивов трансгенов часто выше, чем из эндогенного локуса. Кроме того, флуоресцентные белки довольно объемны, поэтому гибридные белки может не отображать соответствующую локализацию. Кроме того, промоторные элементы, используемые для управления экспрессией трансгенов GFP, часто являются экспрессируется в клетках, в которых эндогенный белок обычно не производится, или наоборот .

Флуоресцентно меченые антитела, генерируемые против выбранного белка, позволяют проводить прямое исследование эндогенных немодифицированных белки, что дает более четкую оценку того, где локализуется эндогенная экспрессия. Антитела, связанные с частицами золота, могут также может использоваться для электронной микроскопии для детального изучения субклеточной локализации. Антитела могут маркировать только фиксированные тканей, поэтому их нельзя использовать для наблюдения в реальном времени за динамикой локализации белка.К тому же фиксация часто разрушает клеточную структуру, ограничивая разрешение, полученное при иммуноокрашивании. Подробные протоколы использования антител можно найти в главе об экспрессии генов.

2.3.4. Микроскопия флуоресцентно меченых клеток

В настоящее время коммерчески доступно несколько микроскопов для генерации и исследования флуоресцентных сигналов.Все умеют разрешить флуоресцентные сущности как в пространстве, так и во времени. Различия между этими микроскопами заключаются в пространственном и временном разрешении. сила.

2.3.4.1. Рассекающий флуоресцентный микроскоп

Этот бинокулярный микроскоп позволяет визуализировать ярко выраженные флуоресцентные сигналы при малом увеличении.Основное использование Инструмент предназначен для визуализации белков, меченных GFP и DsRed, у живых червей на поверхности стандартных чашек с агаром. Как правило, использование этого микроскопа позволяет отобрать животных, экспрессирующих интересующий гибридный белок, а также исследовать очень грубых клеточных характеристик (например, наличия или отсутствия нейронного отростка) для генетического скрининга (см., например, Shaham and Bargmann, 2002). Этот метод не позволяет исследовать тонкую структуру.Микроскоп состоит из стандартного бинокулярного рассекающего микроскопа. оснащен эпифлуоресценцией.

2.3.4.2. Составной флуоресцентный микроскоп

Этот микроскоп имеет значительно более высокое разрешение и увеличение по сравнению с рассекающим флуоресцентным микроскопом, и наблюдение можно комбинировать с ДВС (рис. 5).Часто используются объективы 100Х, которые позволяют исследовать общую субклеточную локализацию белков. Собранные изображения от такого микроскопа при большом увеличении страдают от обширного фона флуоресцентного света, испускаемого клетками, не в плоскости фокуса и рассеянного света. Это часто сильно снижает разрешающую способность этого микроскопа. Однако, для исследования образцов при первом прохождении или для исследования сильно локализованных сигналов этот микроскоп часто является инструментом по выбору (более подробное описание см. http: // www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html).

2.3.4.3. Деконволюционный флуоресцентный микроскоп

Этот прибор представляет собой составной флуоресцентный микроскоп, оснащенный чувствительной системой обнаружения света.Легкий полученные с оптических срезов через образец обрабатываются с помощью сложного компьютерного программного обеспечения, которое определяет расфокусировку свет в правильную фокальную плоскость (Wallace et al., 2001). Изображения, полученные с помощью этого микроскопа, состоят из оптических сечений образца и позволяют выполнять трехмерную реконструкцию. флуоресцентного сигнала с небольшим фоном. Разделы также можно проецировать на одно изображение, обеспечивая высокое разрешение искусственные двухмерные изображения (рисунок 6).Все изображения просматриваются на экране компьютера. Временное разрешение метода, как правило, обратно пропорционально Пространственное разрешение. Таким образом, чем больше визуализируется оптических секций, тем больше интервалы времени между коллекциями изображений в любой заданная фокальная плоскость. Этот тип микроскопа неэффективен для исследования процессов, которые происходят с интервалами в секунды или Быстрее.

2.3.4.4. Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп

Этот прибор состоит из составного микроскопа, оснащенного лазером для возбуждения флуорофора, и специальной детекторной установка, состоящая из небольшого отверстия, через которое излучается флуоресцентный свет, производимый только вблизи фокальной плоскости наблюдения может пройти. Свет, проходящий через точечное отверстие, собирается чувствительным детектором света, а изображения создаются на компьютере. экран.Этот метод устраняет расфокусированную флуоресценцию, давая четкие изображения с небольшим фоном (подробнее см. http://www.microscopyu.com/articles/confocal/). Как и в случае с деконволюционным микроскопом, изображения состоят из оптических срезов через образец. Временное разрешение этой микроскопии зависит от нескольких факторов, включая время, необходимое лазеру для сканирования поля зрения, и количество света которые необходимо собрать для визуализации флуоресценции.В отличие от микроскопа деконволюции, который использует весь испускаемый свет по образцу для расчета точки излучения конфокальный микроскоп собирает только свет, проходящий через точечное отверстие, требующие более длительных выдержек или более чувствительных систем обнаружения света.

2.3.4.5. Конфокальный микроскоп с вращающимся диском.

Этот прибор представляет собой разновидность лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Здесь много отверстий расположены по спирали. на диске, который может вращаться с высокой скоростью. Таким образом, временное разрешение может быть отличным (порядка 100 мс или меньше), а фотообесцвечивание обычно не является существенной проблемой, как с другими микроскопами (Nakano, 2002).Изображение отображается в основном как в стандартном конфокальном микроскопе (рис. 7).

2.3.4.6. Многофотонный микроскоп

Выходной сигнал этого микроскопа аналогичен выходному сигналу деконволюционного или конфокального микроскопов.Таким образом, оптические срезы изображений генерируются, которые можно реконструировать, чтобы сформировать трехмерное изображение. Многофотонная микроскопия устраняет расфокусировку свет путем направления возбуждения в фокальную плоскость. Это достигается светящимися фотонами с большой длиной волны и высокой плотность на образец. В фокальной плоскости длинноволновые фотоны могут накладываться друг на друга, становясь, по сути, более коротковолновыми. фотон.Этот фотон теперь может возбуждать флуорофор и вызывать флуоресценцию. Суперпозиция фотонов происходит значительно только в фокальной плоскости. Многофотонная микроскопия также полезна для изучения образцов, которые намного толще конфокальной. или образцы деконволюции с почти эквивалентным разрешением (Helmchen and Denk, 2002; Michalet et al., 2003).

2.4. Электронная микроскопия.

Электронная микроскопия (ЭМ) в настоящее время является методом выбора для исследования субклеточных структур у C. elegans . Разрешение, предлагаемое этой техникой, не имеет себе равных, позволяя объектам размером с рибосомы или даже меньше их. быть просмотренным. Хотя ЭМ технически требовательна, она того стоит, если важно разрешение небольших структур.Трансмиссионная ЭМ (ТЕМ) обычно включает фиксацию животных любой комбинацией глютеральдегида, параформальдегида или тетраоксид осмия (OsO ₄ ), заделка фиксированных животных в специальной смоле, срезы животных (срезы обычно толщиной 50–100 нм), окрашивание и изображения на электронном микроскопе (Hall, 1995; рис. 8 и 9). Условия фиксации обычно являются ключом к успешному ЭМ эксперименту. Стандартные процедуры с фиксаторами подходят однако для большинства приложений они имеют тот недостаток, что ячеистые структуры часто слегка искажаются из-за осмотический дисбаланс и другие повреждения, возникающие во время процедуры фиксации.Замораживание под высоким давлением (HPF) недавно было используется, чтобы избежать этих проблем. Ткани и клетки обычно более округлые, а ультраструктура, кажется, более точно отражает структуры in vivo (Рисунок 10). Поскольку фиксация HPF только недавно стала известна в C. elegans , ряд проблем еще предстоит решить с помощью этой техники. В частности, результаты часто более изменчивы, чем при использовании стандартная фиксация. Кроме того, эмбрионы и личинки L1, кажется, исправляются лучше, чем более старые стадии.Интересно, что фиксация эмбриона использование стандартных методов довольно сложно, таким образом, HPF и стандартные методы в некоторой степени дополняют друг друга.

Поскольку фиксация очень важна для хорошей ультраструктуры, ниже мы представляем несколько альтернативных протоколов для ПЭМ. В конце В разделе мы представляем метод сканирования ЭМ (СЭМ) червей. В этом методе просматриваются целые животные или конструкции. by EM, предлагая как крупномасштабные изображения, так и изображения с высоким разрешением (рис. 11).

Приведенные ниже протоколы предназначены для того, чтобы дать представление о типах процедур фиксации, используемых для ЭМ, и должны использоваться в качестве руководящих указаний. для тех, у кого есть предыдущий опыт работы с EM. Эти протоколы не предназначены для обучения ЭМ с нуля.

4.Конкретные методы в клеточной биологии C. elegans

Эндоцитоз был изучен на двух типах клеток у C. elegans : целомоцитах и ​​ооцитах (Fares and Greenwald, 2001; Grant and Hirsh, 1999). Эндоцитоз целомоцитов обычно оценивают по поглощению белков, конъюгированных с красителями, которые вводятся в полость тела. Эндоцитоз ооцитов измеряют по поглощению GFP-меченного белка желтка, секретируемого кишечником.Ниже приведены протоколы для обоих анализы.

4.2. Биология хроматиновых клеток (Дьёрдьи Чанковски и Барбара Мейер)

Конкретные хромосомные последовательности, а также хромосомно-ассоциированные белки могут быть элегантно помечены как C.elegans с использованием иммунофлуоресценции и флуоресценции in situ гибридизации (FISH) (Фиг.12). В целом сигналы легче обнаружить и разрешить в более крупных ядрах, поэтому наилучшие результаты достигаются при изучении зародыша. клетки, клетки кишечника и клетки раннего эмбриона. Представлены различные протоколы, связанные с визуализацией хроматина. ниже.

4.3. Запрограммированная гибель клеток (Барбара Конрад, Джулия Хатцольд, Клаус Шертль)

4.3.1. Обнаружение умирающих клеток

Умирающие клетки можно определить по их морфологии и преломляющей способности с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии (ДИК; см. выше; Сулстон и Хорвиц, 1977).Труп клетки выглядит как сильно преломляющая, похожая на кнопку структуру (рис. 13), которая быстро поглощается и разрушается соседними клетками. Смерть клеток происходит в соме C. elegans в основном во время эмбриогенеза и в женской зародышевой линии как нормальный ход развития (Gumienny et al., 1999). Гибель зародышевых клеток также может быть вызвана повреждающими ДНК агентами или патогенными бактериями (Aballay and Ausubel, 2001; Gartner et al., 2000). Ниже мы представляем несколько протоколов для обнаружения умирающих клеток в соме и зародышевой линии.

TUNEL ( T dT-mediated dUTP Nick End Labeling) маркирует концы ДНК и, следовательно, умирающие клетки, в которых ДНК деградирует (Gavrieli et al., 1992). TUNEL можно использовать в качестве маркера умирающих клеток и для анализа деградации ДНК. Деградация ДНК происходит очень быстро во время гибель клеток, таким образом, TUNEL окрашивает апоптотические клетки только во время переходной стадии деградации ДНК.По этой причине обычно только небольшая часть трупов помечена этой техникой. Однако у мутантов nuc-1 , которые дефектны в некоторых аспектах деградации ДНК, ядра многих умирающих клеток могут быть помечены с использованием этого метод (Wu et al., 2000).

SYTO (молекулярные зонды) четко маркируют ДНК во всех клетках.Однако конденсированная ДНК в апоптотических клетках («мертвых ядрах») окрашивает ярче, чем ДНК в живых клетках. SYTO11, SYTO12 и акридиновый апельсин дали наилучшие результаты (Gumienny et al., 1999; Wu et al., 2000; Рисунок 14).

4.3.1.3. Визуализация умирающих половых клеток с помощью CED-1 :: GFP

P _lim-7 ced-1 :: gfp экспрессирует слитый белок CED-1 :: GFP под контролем промотора lim-7 (Zhou et al., 2001). Промотор lim-7 специфически управляет экспрессией в клетках оболочки, которые образуют гонадную трубку. Эти клетки отвечают за поглощение умирающих половых клеток.Ячейка CED-1 pro

| Определение, типы и функции

Клетки — это основные единицы жизни.

Клетка , в биологии, основная мембраносвязанная единица, которая содержит основные молекулы жизни и из которой состоит все живое. Одна клетка часто сама по себе является целостным организмом, например, бактериями или дрожжами.Другие клетки приобретают специализированные функции по мере созревания. Эти клетки взаимодействуют с другими специализированными клетками и становятся строительными блоками больших многоклеточных организмов, таких как люди и другие животные. Хотя клетки намного больше атомов, они все же очень маленькие. Самые маленькие из известных клеток — это группа крошечных бактерий, называемых микоплазмами; некоторые из этих одноклеточных организмов представляют собой сферы диаметром всего 0,2 мкм (1 мкм = примерно 0,000039 дюйма) с общей массой 10 ^{— 14} грамм, что равно 8 000 000 000 атомов водорода.Клетки человека обычно имеют массу в 400 000 раз больше, чем масса отдельной бактерии микоплазмы, но даже клетки человека имеют только около 20 мкм в поперечнике. Для того, чтобы закрыть булавочную головку, потребуется лист из примерно 10 000 человеческих клеток, а каждый человеческий организм состоит из более чем 30 000 000 000 000 клеток.

Основные структуры животной клетки Цитоплазма окружает специализированные структуры клетки, или органеллы. Рибосомы, места синтеза белка, находятся в цитоплазме в свободном состоянии или прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму, через который материалы транспортируются по клетке.Энергия, необходимая клетке, выделяется митохондриями. Комплекс Гольджи, стопки сплюснутых мешочков, обрабатывает и упаковывает материалы, которые должны быть выпущены из клетки в секреторные пузырьки. Пищеварительные ферменты содержатся в лизосомах. Пероксисомы содержат ферменты, выводящие токсины из опасных веществ. Центросома содержит центриоли, которые играют роль в делении клеток. Микроворсинки — это пальцевидные отростки, обнаруженные на определенных клетках. Реснички, похожие на волосы структуры, которые выходят на поверхность многих клеток, могут создавать движение окружающей жидкости.Ядерная оболочка, двойная мембрана, окружающая ядро, содержит поры, которые контролируют движение веществ в нуклеоплазму и из нее. Хроматин, комбинация ДНК и белков, образующих хромосомы, составляет большую часть нуклеоплазмы. Плотное ядрышко является местом образования рибосом.

Популярные вопросы

Что такое ячейка?

Клетка — это масса цитоплазмы, которая снаружи связана клеточной мембраной. Обычно микроскопические по размеру клетки представляют собой мельчайшие структурные единицы живого вещества и составляют все живое.Большинство клеток имеет одно или несколько ядер и других органелл, которые выполняют множество задач. Некоторые отдельные клетки представляют собой полноценные организмы, такие как бактерии или дрожжи. Другие представляют собой специализированные строительные блоки многоклеточных организмов, таких как растения и животные.

Что такое клеточная теория?

Теория клетки утверждает, что клетка является фундаментальной структурной и функциональной единицей живого вещества. В 1839 году немецкий физиолог Теодор Шванн и немецкий ботаник Матиас Шлейден обнародовали, что клетки являются «элементарными частицами организмов» как у растений, так и у животных, и признали, что некоторые организмы одноклеточные, а другие многоклеточные.Эта теория ознаменовала собой большой концептуальный прогресс в биологии и привела к возобновлению внимания к живым процессам, происходящим в клетках.

Что делают клеточные мембраны?

Клеточная мембрана окружает каждую живую клетку и отделяет клетку от окружающей среды. Он служит барьером, препятствующим проникновению содержимого клетки и проникновению нежелательных веществ. Он также функционирует как ворота для активного и пассивного перемещения основных питательных веществ в клетку и отходов из нее.Определенные белки клеточной мембраны участвуют в межклеточной коммуникации и помогают клетке реагировать на изменения в окружающей среде.

В этой статье клетка рассматривается как отдельная единица и как часть большого организма. Как отдельная единица, клетка способна метаболизировать свои собственные питательные вещества, синтезировать многие типы молекул, обеспечивать свою собственную энергию и воспроизводить себя, чтобы производить последующие поколения. Его можно рассматривать как закрытый сосуд, внутри которого одновременно происходят бесчисленные химические реакции.Эти реакции находятся под очень точным контролем, поэтому они способствуют жизни и размножению клетки. В многоклеточном организме клетки становятся специализированными для выполнения различных функций в процессе дифференцировки. Для этого каждая ячейка поддерживает постоянную связь со своими соседями. Получая питательные вещества из окружающей среды и выбрасывая отходы, она прилипает к другим клеткам и взаимодействует с ними. Совместные сборки одинаковых клеток образуют ткани, а сотрудничество между тканями, в свою очередь, формирует органы, которые выполняют функции, необходимые для поддержания жизни организма.

Особое внимание в этой статье уделяется животным клеткам с некоторым обсуждением процессов синтеза энергии и внеклеточных компонентов, присущих растениям. (Подробное обсуждение биохимии растительных клеток, см. Фотосинтез . Для полной обработки генетических событий в ядре клетки, см. Наследственность .)

Природа и функция клеток

A клетка окружена плазматической мембраной, которая образует селективный барьер, позволяющий питательным веществам проникать, а отходам — ​​выходить.Внутренняя часть клетки состоит из множества специализированных отсеков или органелл, каждый из которых окружен отдельной мембраной. Одна из основных органелл, ядро, содержит генетическую информацию, необходимую для роста и размножения клеток. Каждая клетка содержит только одно ядро, тогда как другие типы органелл присутствуют в нескольких копиях в клеточном содержимом или цитоплазме. Органеллы включают митохондрии, которые отвечают за передачу энергии, необходимую для выживания клеток; лизосомы, которые переваривают нежелательные материалы внутри клетки; и эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, которые играют важную роль во внутренней организации клетки, синтезируя выбранные молекулы, а затем обрабатывая, сортируя и направляя их в нужное место.Кроме того, клетки растений содержат хлоропласты, которые отвечают за фотосинтез, благодаря чему энергия солнечного света используется для преобразования молекул углекислого газа (CO ₂ ) и воды (H ₂ O) в углеводы. Между всеми этими органеллами есть пространство в цитоплазме, называемое цитозолем. Цитозоль содержит организованный каркас из волокнистых молекул, составляющих цитоскелет, который придает клетке ее форму, позволяет органеллам перемещаться внутри клетки и обеспечивает механизм, с помощью которого сама клетка может двигаться.Цитозоль также содержит более 10 000 различных видов молекул, которые участвуют в клеточном биосинтезе, процессе создания больших биологических молекул из маленьких.

Клетки животных и растений содержат мембраносвязанные органеллы, включая отдельное ядро. Напротив, бактериальные клетки не содержат органелл.

Специализированные органеллы характерны для клеток организмов, известных как эукариоты.Напротив, клетки организмов, известных как прокариоты, не содержат органелл и обычно меньше эукариотических клеток. Однако все клетки имеют сильное сходство в биохимической функции.

Изображение эукариотической клетки в разрезе.

Молекулы клеток

Клетки поглощают молекулы через свои плазматические мембраны.

Клетки содержат особый набор молекул, которые заключены в мембрану. Эти молекулы дают клеткам возможность расти и воспроизводиться. Общий процесс клеточного размножения происходит в два этапа: рост клеток и деление клеток. Во время роста клетки клетка поглощает определенные молекулы из своего окружения, выборочно проводя их через клеточную мембрану. Попадая в клетку, эти молекулы подвергаются действию узкоспециализированных, больших, тщательно свернутых молекул, называемых ферментами.Ферменты действуют как катализаторы, связываясь с проглоченными молекулами и регулируя скорость их химического изменения. Эти химические изменения делают молекулы более полезными для клетки. В отличие от проглоченных молекул, катализаторы не изменяются химически во время реакции, что позволяет одному катализатору регулировать конкретную химическую реакцию во многих молекулах.

Биологические катализаторы создают цепочки реакций. Другими словами, молекула, химически преобразованная одним катализатором, служит исходным материалом или субстратом для второго катализатора и так далее.Таким образом, катализаторы используют небольшие молекулы, принесенные в клетку из внешней среды, для создания все более сложных продуктов реакции. Эти продукты используются для роста клеток и воспроизведения генетического материала. После копирования генетического материала и наличия достаточного количества молекул для поддержания деления клетки клетка делится, образуя две дочерние клетки. Через множество таких циклов клеточного роста и деления каждая родительская клетка может дать начало миллионам дочерних клеток, в процессе преобразования больших количеств неодушевленного вещества в биологически активные молекулы.

Границы | Методы сегментации и классификации изображений тканей с цифровой микроскопии

Введение

Рак вызывает изменения в тканях на субклеточном уровне. Патологи исследуют образец ткани под мощным микроскопом, чтобы найти аномалии, указывающие на рак. Этот ручной процесс традиционно был стандартом де-факто для диагностики и классификации раковых опухолей. Хотя он по-прежнему широко применяется в клинических условиях, ручное исследование ткани является субъективным, качественным анализом и не масштабируется до трансляционных и клинических исследований, включающих сотни или тысячи образцов тканей.С другой стороны, количественный анализ нормальной и опухолевой ткани может дать новое понимание наблюдаемых и скрытых характеристик субклеточной ткани и может привести к лучшему пониманию механизмов, лежащих в основе возникновения и прогрессирования рака (Madabhushi, 2009; Chennubhotla et al. , 2017; Cooper et al., 2018).

За последние 20 лет технология визуализации целых слайдов значительно продвинулась вперед. Мы называем цифровые изображения образцов тканей, окрашенных и зафиксированных на предметном стекле, как целые изображения ткани на предметном стекле (WSI) .Высокодетализированные изображения тканей с разрешением от 20 000 x 20 000 пикселей до более 100 000 x 100 000 пикселей могут быть быстро получены с помощью современных сканеров изображений тканей. Усовершенствования в области хранения и вычислительной техники также сделали возможным хранение и анализ WSI. Эти достижения предоставляют значительные возможности для количественного анализа морфологии тканей. Количественный анализ не только позволяет исследователям собрать более подробное описание структуры и неоднородности опухоли, но также позволяет проводить исследования с большим количеством образцов тканей.Поскольку возможность быстро генерировать большие объемы данных WSI стала возможной и все более широко используется, растет потребность в надежных и эффективных (полу) автоматизированных компьютерных методах в дополнение к традиционному ручному исследованию тканей.

Двумя наиболее распространенными задачами при анализе изображения ткани целого слайда являются сегментация микроскопических структур, таких как ядра и клетки, в опухолевых и неопухолевых областях и классификация областей изображения и целых изображений. Компьютеризированное обнаружение и сегментация ядер — одна из основных операций в анализе гистопатологических изображений.Эта операция имеет решающее значение для извлечения, анализа и интерпретации субклеточной морфологической информации из цифровых изображений слайдов. Раковые ядра во многом отличаются от других ядер и по-разному влияют на ткань. Точные количественные характеристики формы, размера и текстурных свойств ядер являются ключевыми компонентами изучения биологии опухолевых систем и сложных паттернов взаимодействия между опухолевыми клетками и другими клетками. Классификация изображений, выполняемая с сегментацией или без нее, присваивает метку класса области изображения или изображению.Это ключевой шаг в вычислении категоризации с помощью функций визуализации пациентов в группы для отбора когорт и корреляционного анализа. Методы сегментации и классификации были предложены в нескольких исследовательских проектах (Gurcan et al., 2009; Ghaznavi et al., 2013; Xie et al., 2015; Xu et al., 2015; Manivannan et al., 2016; Peikari and Martel, 2016; Sirinukunwattana et al., 2016; Wang et al., 2016; Xing and Yang, 2016; Al-Milaji et al., 2017; Chen et al., 2017; Zheng et al., 2017; Graham and Rajpoot , 2018; Сенарас, Гуркан, 2018).Xing and Yang (2016) дают хороший обзор алгоритмов сегментации для гистопатологических изображений. Алгоритм CNN был разработан Zheng et al. (2017), чтобы проанализировать гистопатологические изображения для извлечения и характеристики распределения ядер на изображениях образцов тканей. Метод, основанный на ансамблях машин опорных векторов для обнаружения и классификации клеточных паттернов на изображениях тканей, был предложен Manivannan et al. (2016). Аль-Миладжи и др. разработал основанный на CNN подход для классификации участков ткани на стромальные и эпителиальные на изображениях тканей, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E) (Al-Milaji et al., 2017). Xu et al. (2015) использовали предварительно обученную модель CNN для извлечения функций из исправлений. Эти характеристики объединяются для классификации изображений тканей целого слайда. Метод, который изучает специфичные для класса словари для классификации изображений гистопатологии, был предложен Vu et al. (2016). Kahya et al. (2017) использовали вспомогательные векторные машины для классификации гистопатологических изображений рака груди. В их методе используются машины с разреженными опорными векторами и тест суммы рангов Уилкоксона для определения и оценки весов характеристик изображения.Peikari et al. (2018) разработали подход, в котором кластеризация выполняется для входных данных для определения структуры пространства данных. За этим следует полууправляемый метод обучения для выполнения классификации с использованием информации о кластеризации. Пейкари и Мартель (2016) предлагают этап преобразования цвета, который отображает цветовое пространство красный-зеленый-синий путем вычисления собственных векторов пространства RGB. Затем цветное изображение используется для сегментации ячеек. Chen et al. (2017) предлагают сеть глубокого обучения, которая реализует платформу многозадачного обучения через многоуровневые сверточные сети для обнаружения и сегментации объектов на изображениях тканей.

Несмотря на большой объем исследовательских работ по классификации и сегментации изображений, процесс извлечения, анализа и интерпретации информации из цифровых изображений слайдов остается сложной задачей (Xie et al., 2016; Xing et al., 2016; Chennubhotla et al. ., 2017; Senaras, Gurcan, 2018). Алгоритмы сегментации и классификации должны решить ряд проблем. Во-первых, морфология опухоли и нормальной ткани различается в разных образцах тканей — как в разных типах рака, так и в образцах тканей одного типа рака.Даже один образец ткани будет содержать множество ядер и других структур. Алгоритмы должны учитывать неоднородность тканей, а также обучаться и динамически адаптироваться к вариациям морфологии ткани в разных образцах ткани. Нередко алгоритм, использующий фиксированные входные параметры, подходит для одного изображения, но плохо для другого. Во-вторых, ядра на изображении ткани касаются друг друга или перекрывают друг друга. Это и результат биологических процессов, и артефакт захвата изображения. Слайд ткани будет иметь некоторую глубину, какой бы небольшой она ни была.Сканирование образца ткани с помощью цифрового светового микроскопа может непреднамеренно захватить ядра в различных фокальных плоскостях. Сгруппированные ядра затрудняют процесс сегментации. В-третьих, изображения целых слайдов являются изображениями с очень высоким разрешением и не помещаются в основную память и память графического процессора на большинстве машин. Таким образом, алгоритм классификации может быть неприменим для работы со всем изображением в целом. Алгоритмы должны быть разработаны для работы с несколькими разрешениями или фрагментами изображений.

В этой статье мы представляем и экспериментально оцениваем два новых алгоритма, один из которых разработан для сегментации ядер, а другой — для классификации изображений целых слайдов ткани:

• Алгоритм сегментации предлагает многомасштабную сеть глубокой остаточной агрегации для точной сегментации ядер и разделения слипшихся ядер.Наш метод состоит из трех основных шагов. Сначала он обнаруживает ядерные капли и границы через группу CNN. Затем он применяет алгоритм водораздела к результатам первого шага, чтобы выполнить начальное разделение слипшихся ядер. На последнем этапе выполняется уточненная сегментация отдельных ядер из второго этапа. В предлагаемом методе используется многомасштабный подход для улучшения характеристик обнаружения и сегментации, поскольку размеры ядер различаются в разных образцах ткани и внутри образца ткани.Оценка алгоритма сегментации с использованием набора фрагментов изображений из мультиформной глиобластомы (GBM), глиомы более низкой степени (LGG), плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC) и немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) показала, что алгоритм смог достичь точности сегментации 0,78. Алгоритм не только способен точно сегментировать ядерный материал, но и разделять соприкасающиеся и перекрывающиеся ядра на отдельные объекты.

• Алгоритм классификации предлагает автоматизированный метод, состоящий из двух частей, для решения проблемы классификации гистологических изображений немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ).Этот метод сначала классифицирует все входные пятна от невидимого WSI как NSCLC адено (LUAD) или плоскоклеточный NSCLC (LUSC) или недиагностические (ND) и получает соответствующие карты вероятности для каждого класса. Затем он извлекает набор статистических и морфологических характеристик из карт вероятностей LUAD и LUSC в качестве входных данных в регрессионную модель случайного леса для классификации каждого WSI. Этот метод является первой сетью с тремя классами, целью которой является разделение каждого WSI на диагностические и недиагностические области. Результаты экспериментов показывают точность 0.81.

Эти два алгоритма достигли наивысших баллов в решении задачи цифровой патологии вычислительной прецизионной медицины, организованной на 20-й Международной конференции по медицинской обработке изображений и компьютерному вмешательству 2017 г. (MICCAI 2017), Квебек, Канада. Это испытание было организовано некоторыми соавторами этой рукописи (Кейван Фарахани, Тахсин Курк, Джаяшри Калпати-Крамер, Джоэл Зальц при поддержке опытного патологоанатома, предоставленной Тяньхао Чжао и Раджарси Гупта при подготовке наборов данных для испытаний), чтобы предоставить платформу для оценка алгоритмов классификации и сегментации и является частью серии ежегодных задач цифровой патологии, проводимых с 2014 года.Задача 2017 года нацелена на изображения тканей, полученные у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), плоскоклеточным раком головы и шеи (HNSCC), мультиформной глиобластомой (GBM) и опухолями глиомы более низкого уровня (LGG). Эти типы рака представляют собой сложные и смертельные заболевания, на которые приходится большое количество смертей пациентов при диагностике, несмотря на применение различных стратегий лечения. В дополнение к методологическим вкладам, представленным в этом документе, мы сделаем общедоступными наборы данных, использованные в исследовании цифровой патологии MICCAI 2017, для использования другими исследователями.

Остальная часть рукописи организована следующим образом. В разделе «Материалы и методы» мы представляем алгоритм сегментации ядра и алгоритм классификации. Мы представляем экспериментальную оценку алгоритмов в разделе Результаты. Мы описываем проблему цифровой патологии MICCAI 2017 и наборы данных проблемы в том же разделе. Завершаем в разделе Обсуждение.

Материалы и методы

Сегментация ядер методом глубокого обучения

Мы разработали подход сверточных нейронных сетей (CNN) для точной сегментации ядер.Метод состоит из трех основных этапов: (1) обнаружение сгустков ядер и границ с помощью CNN, (2) разделение соприкасающихся (или перекрывающихся) ядер путем объединения результатов обнаружения сгустков ядер и границ с помощью алгоритма водораздела и (3) окончательное сегментация отдельных ядер. Весь рабочий процесс показан на рисунке 1.

Рисунок 1 . Обзор процедуры сегментации ядер. DRAN _BL и DRAN _BD являются моделями для обнаружения блобов ядра и обнаружения границ, соответственно.

Две CNN обучены выполнять начальный блоб ядра и обнаружение границ. Эти CNN состоят из двух последовательных путей обработки — сужающийся путь и расширяющийся путь — и нацелены на получение всех ядерных пикселей и ядерных граничных пикселей в изображении ткани, генерации ядер сгустков и пограничных масок соответственно. При наличии масок сгустков и границ начальная сегментация ядер выполняется в два этапа: (1) удаление идентифицированных границ ядер и (2) разделение оставшихся сгруппированных ядер.Чтобы удалить границы ядер, мы просто вычитаем маску границы из маски капли после расширения маски границы ядром размером 3 × 3. Затем применяется алгоритм водораздела для идентификации отдельных ядер ядер. Впоследствии каждый из удаленных граничных пикселей назначается ближайшему ядру ядра, что приводит к сегментации отдельных ядер. Между тем, размер каждой капли ядра исследуется для устранения артефактов (> 13 мкм ² ).

Сетевая архитектура

Предлагаемая сеть глубокого остаточного агрегирования (DRAN) проиллюстрирована на рисунке 2.Он следует известной парадигме двух последовательных путей обработки: сокращающийся путь (понижающая дискретизация входа) и расширяющийся путь (повышающая дискретизация вывода сокращающегося пути), например, в U-Net (Ronneberger et al., 2015), SegNet (Badrinarayanan et al., 2017), FCN (Long et al., 2015) и Hypercolumns (Hariharan et al., 2015) с несколькими основными и незначительными модификациями.

Рисунок 2 . Архитектура сети глубокой остаточной агрегации (DRAN) для сегментации ядер.Модифицированный предварительно активированный ResNet50 используется для контрактного пути.

Контрактный тракт

Сужающийся путь можно рассматривать как этап извлечения признаков, распознающий приблизительное положение целевых объектов и кодирование их локальных характеристик. Для этого мы используем предварительно активированный ResNet50 (He et al., 2016a). В отличие от оригинального ResNet50 (He et al., 2016b), который использует схему свертки — пакетной нормализации — выпрямленного линейного блока (ReLU) для остаточных единиц, архитектура предварительной активации вместо этого принимает схему пакетной нормализации — ReLU — свертки и упрощает прямое распространение входных данных по сокращенному пути.В предварительно активированный ResNet50 внесены некоторые изменения; первая свертка 7 × 7 выполняется с шагом 1 и без заполнения. Максимальное объединение после первой свертки 7 × 7 было удалено.

Расширяющийся путь

Расширяющийся путь включает четыре уровня обработки (или декодирования). Первый уровень принимает выходные данные последнего слоя сокращающегося пути и выполняет транспонированную свертку и повышающую дискретизацию. Второй, третий и четвертый уровни получают два входа — один от предыдущего слоя, а другой — от сокращающегося пути.Два входа складываются и проходят декодер и блок изменения размера. В отличие от U-Net или DCAN (Chen et al., 2017), модуль изменения размера просто удваивает размер входных данных с помощью интерполяции ближайшего соседа, что с вычислительной точки зрения не требует больших затрат. Более того, вместо использования конкатенации, как в Ronneberger et al. (2015), использование операторов сложения сокращает использование памяти без существенной потери обучаемости сети. Декодер — это первичный процессор, который играет ключевую роль в интерпретации информации с разных уровней абстракции и создании более точных карт сегментации на расширяющемся пути.Он выполняет серию операций свертки, используя многолучевую архитектуру (Xie et al., 2017), где входные и выходные каналы разделены на несколько непересекающихся групп (или путей), и каждый из них выполняет свертку отдельно. Все операции свертки в декодере не используют заполнение и шаг 1. Из-за свертки без заполнения размер карты сегментации становится меньше размера входного изображения. В нашей сети используются три декодера. У них одинаковая компоновка, но с разным количеством каналов и путей.Подробности представлены в таблице 1.

Таблица 1 . Подробная информация о трех декодерах.

Мультимасштабное агрегирование

Размеры ядер существенно различаются в разных образцах тканей, даже в пределах одного образца. Чтобы лучше охарактеризовать ядра и повысить производительность сегментации, мы применяем многомасштабный подход. Размер изображений образцов тканей изменяется в 2 и 0,5 раза. Изображения с измененным размером отдельно загружаются в DRAN. Таким образом, в общей сложности обучены и подготовлены три DRAN: одна в исходном масштабе (x1.0), а два других имеют масштаб x2 и x0,5. Последний слой softmax каждой DRAN удаляется, и выходные данные decoder1 агрегируются через другой декодер ( decoder4 ), генерируя окончательную карту сегментации в исходном масштабе. Отметим, что decoder4 использует свертку с заполнением. Детали многомасштабной архитектуры показаны на рисунке 3. Эта сеть называется многомасштабной сетью глубокой остаточной агрегации (MDRAN).

Рисунок 3 .Архитектура многомасштабной глубокой остаточной сети (MDRAN). MDRAN состоит из 3 DRAN в 3 масштабах (x0,5, x1,0, x2,0) и декодера (в штриховом прямоугольнике), объединяя вместе 3 шкалы и генерируя карту сегментации в масштабе x1,0. В декодере блок свертки [128, 5 × 5, 256] обозначает [128 входных каналов, ядро ​​5 × 5, 256 выходных каналов].

Классификация полных слайд-изображений автоматическим методом из двух частей

В последние годы появилось несколько опубликованных методов автоматической классификации НМРЛ.Yu et al. (2016) извлекли ряд количественных характеристик изображения из областей ткани и использовали ряд классических машинных методов для классификации каждой WSI. Хотя ручные подходы работают хорошо, наблюдается растущая тенденция к подходам к глубокому обучению, когда сети способны изучать сильное представление функций. В результате такого сильного представления признаков недавние глубокие сети (Симонян и Зиссерман, 2014; Сегеди и др., 2015; Хе и др., 2016a; Хуанг и др., 2017) достигли поразительной точности в распознавании крупномасштабных изображений. задачи (Deng et al., 2009). В большинстве методов классификации WSI используется патч-основанный подход из-за вычислительных трудностей при обработке мультигигапиксельных изображений. Coudray et al. (2018) классифицировали WSI NSCLC с использованием глубокого обучения на основе патча за патчем, но также предсказали десять наиболее часто мутирующих генов. Для классификации рака легких авторы использовали сетевую архитектуру Inception v3, чтобы классифицировать входные патчи на LUAD, LUSC и нормальные. Они предположили, что все пятна в каждом WSI имеют одну и ту же метку и поэтому не различают диагностические и недиагностические области.Этот метод может привести к большому количеству ложных срабатываний в недиагностических областях, и обучение может занять много времени, чтобы сойтись. Hou et al. (2016) обучили классификатор на уровне пластырей классифицировать глиомы и НМРЛ WSI по различным типам рака. Это было сделано путем агрегирования различительных предсказаний на уровне патчей из глубокой сети с использованием либо модели логистической регрессии с несколькими классами, либо машины опорных векторов. Выбор отличительных пятен производился слабо контролируемым образом, при этом для итеративного выбора участков использовался подход максимизации ожидания.Затем эти патчи загружались в обычную двухклассовую CNN для классификации входных патчей как LUAD или LUSC. Авторы этого метода решают проблему различения диагностических и недиагностических областей, рассматривая только дискриминационные участки. Несмотря на успех, этот метод, скорее всего, потерпит неудачу, если будет представлен небольшой нерепрезентативный набор данных.

В результате вышеупомянутых недостатков мы представляем метод классификации немелкоклеточного рака легкого, который в первую очередь фокусируется на диагностических областях изображения для определения типа рака.В разделе «Сетевая архитектура» мы описываем структуру глубокого обучения для классификации на основе патчей. В разделе «Извлечение статистических и морфологических признаков и регрессионная модель случайного леса» мы описываем регрессионную модель случайного леса для классификации всего изображения слайда как LUAD или LUSC. Общий обзор структуры классификации можно увидеть на рисунке 4.

Рисунок 4 . Обзор структуры классификации НМРЛ. (A) Рабочий процесс для обучения нейронной сети классифицировать входные пятна как недиагностические (ND), аденокарциному легкого (LUAD) или плоскоклеточный рак легкого (LUSC). (B) Рабочий процесс обработки WSI в тестовом наборе для получения карт вероятностей для каждого класса. (C) Рабочий процесс для модели регрессии случайного леса. Объекты извлекаются из карт вероятностей LUAD и LUSC, а затем вводятся в качестве входных данных в модель случайного леса. SN обозначает нормализацию окраски по методу Reinhard et al. (2001).

Сетевая архитектура

Вдохновленный успехом ResNet (He et al., 2016b) в задачах распознавания изображений (Huang et al., 2017), мы реализовали глубокую нейронную сеть с остаточными блоками в ее ядре для классификации входных патчей NSCLC. Эта сетевая архитектура является вариантом ResNet50, как описано He et al. (2016b), но мы используем ядро ​​3 × 3 вместо ядра 7 × 7 во время первой свертки и уменьшаем количество параметров во всей сети. Использование ядра 3 × 3 важно в этой области, потому что меньшее воспринимающее поле необходимо для обнаружения мелких особенностей, которые являются общими для гистологических изображений. Уменьшение количества параметров позволяет сделать сеть более универсальной и снижает вероятность переобучения.Чтобы уменьшить количество параметров, мы модифицировали ResNet50 (He et al., 2016b), уменьшив количество остаточных блоков по всей сети, так что у нас было 32 слоя вместо 50. Из-за высокой вариабельности между изображениями и поэтому между набором для обучения и проверки решающее значение имеет предотвращение чрезмерной подгонки. На рисунке 5 представлен обзор сетевой архитектуры.

Рисунок 5 . Глубокая сверточная нейронная сеть. (A) Сетевая архитектура, (B) остаточная единица.В остаточном блоке ⊕ относится к оператору суммирования. (C) Клавиша, выделяющая каждый компонент рабочего процесса. Обратите внимание, что число внутри каждого сверточного оператора обозначает глубину вывода. Над каждым остаточным блоком мы указываем, сколько остаточных единиц используется.

После завершения обучения мы выбрали оптимальную эпоху, соответствующую максимальной средней точности проверки, и обработали патчи из каждого тестового WSI. Это привело к трем вероятностным картам; по одному на каждый класс.

Извлечение статистических и морфологических признаков

Для классификации каждого WSI как аденокарциномы легкого или плоскоклеточного рака легкого мы извлекли признаки из карт вероятности LUAD и LUSC. Мы исследовали два метода постобработки: максимальное голосование и модель регрессии случайного леса. Максимальное голосование просто присваивает классу WSI класс с наибольшим количеством положительных пятен в соответствующей карте вероятности. Следовательно, максимальное голосование требует только положительного подсчета патчей для карт вероятности LUAD и LUSC, чтобы сделать классификацию.Для модели регрессии случайного леса мы извлекли 50 статистических и морфологических признаков из карт вероятности обучения LUAD и LUSC, а затем выбрали 25 лучших признаков на основе разделимости классов. Мы получили карты вероятности обучения путем обработки каждой обучающей WSI с поздней эпохой. Это гарантировало, что сеть полностью соответствует обучающим данным, и обеспечило хорошую сегментацию диагностических областей LUAD и LUSC. Другими словами, использование этого метода позволило нам перейти от неполной к исчерпывающей маркированной карте вероятности.После того, как модель была обучена с использованием этих функций, они были затем введены как функции в регрессионную модель случайного леса. Статистические характеристики, которые были извлечены, включали: среднее, медиану и дисперсию карт вероятности. Мы также рассчитали соотношение между картами вероятностей LUAD и LUSC. Морфологические особенности, которые были извлечены, включали размер пяти верхних связанных компонентов на разных порогах.

Модель регрессии случайного леса

Ансамблевый метод — это набор классификаторов, объединенных вместе для получения улучшенных результатов.Примером такого ансамблевого метода является случайный лес, в котором несколько деревьев решений комбинируются для повышения точности классификации. Деревья решений непрерывно разделяют входные данные в соответствии с определенным параметром, пока не будет выполнен критерий. В частности, регрессионная модель случайного леса подбирает несколько деревьев решений для различных подвыборок данных, а затем вычисляет средний результат всех деревьев решений. Мы оптимизировали нашу модель случайного леса, выбрав ансамбль из 10 упакованных деревьев, случайным образом выбрав одну треть переменных для каждого разделения решений и установив минимальный размер листа равным 5.Наконец, мы выбрали пороговое значение для преобразования выходных данных модели случайной регрессии леса в двоичное значение, указывающее, был ли WSI LUAD или LUSC.

Результаты

Цифровая патология и наборы данных

Мы организовали испытание цифровой патологии MICCAI 2017, чтобы предоставить площадку для сравнения алгоритмов с использованием общего тщательно подобранного набора наборов данных и помочь в продвижении разработки алгоритмов цифровой патологии. Задача 2017 года состояла из двух подзадач; сегментация ядер на изображениях тканей и классификация изображений целых слайдов (WSI).В нем использовались изображения тканей, полученные у пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC), плоскоклеточным раком головы и шеи (HNSCC), мультиформной глиобластомой (GBM) и опухолями глиомы более низкого уровня (LGG). Эти типы рака представляют собой сложные и смертельные заболевания, на которые приходится большое количество смертей пациентов при диагностике, несмотря на применение различных стратегий лечения.

Сегментация ядер на изображениях

В этой подзадаче участникам было предложено применить автоматизированные алгоритмы для обнаружения и сегментации всех ядер в наборе изображений тканей.Набор данных изображения ткани состоял из фрагментов изображения, извлеченных из целых изображений ткани слайда. Плитки изображений использовались вместо полных изображений ткани слайда из-за значительных затрат времени и ресурсов на ручную и точную сегментацию ядер WSI. По нашему опыту, WSI может иметь от сотен тысяч до миллионов ядер. Было бы невозможно создать базовый набор данных даже из одного WSI, не говоря уже о десятках WSI. Кроме того, обработка WSI для сегментации ядра может потребовать значительной вычислительной мощности.Использование тайлов вместо WSI в задаче снизило требования к вычислениям и памяти, поскольку основная цель задачи заключалась в оценке точности выполнения алгоритма.

В этой подзадаче использовались изображения из репозитория Атласа генома рака (TCGA) (Атлас генома рака (TCGA), 2018). Плитки изображений для обучающего и тестового наборов были выбраны патологами из набора изображений целых слайдов GBM, LGG, HNSCC и NSCLC патологами и извлечены с помощью программного обеспечения Aperio ImageScope.Обучающий набор и тестовый набор состояли из 32 плиток изображений по 8 плиток от каждого типа рака. Мы набрали группу студентов, чтобы вручную сегментировать все ядра на плитках изображений. Каждая плитка была сегментирована несколькими учениками с помощью настольного программного обеспечения iPhotoDraw (http://iphotodraw.com). Сегментации студентов были рассмотрены патологами на обзорных сессиях со студентами. В ходе сеансов обзора ручные сегменты были уточнены, и для каждой плитки изображения была сформирована согласованная сегментация.Затем были созданы помеченные маски для представления сегментов вручную. Помеченная маска представляет каждое сегментированное ядро ​​в плитке изображения с различным идентификатором. Всем пикселям, которые являются частью одного ядра, назначается один и тот же идентификатор.

Оценка результата сегментации была вычислена с использованием коэффициента DICE (DICE_1) (Dice, 1945) и варианта коэффициента DICE, который мы реализовали и назвали «Ensemble Dice» (DICE_2, см. Алгоритм 1). Коэффициент DICE измеряет перекрытие между исходными данными и результатами сегментации алгоритма, но не учитывает разбиения и слияния.«Сплит» — это случай, когда человек сегментирует область в одном ядре, но алгоритм сегментирует одну и ту же область в нескольких ядрах. «Слияние» — это случай, когда алгоритм сегментирует область в одном ядре, но человек сегментирует одну и ту же область в нескольких ядрах. С коэффициентом DICE алгоритм, который сегментирует два соприкасающихся (или перекрывающихся) ядра как один объект, будет иметь то же значение DICE_1, что и алгоритм, который правильно сегментирует ядра как два отдельных объекта.DICE_2 был реализован для обнаружения несоответствия в способе разделения истинного значения и алгоритма сегментации области изображения. Псевдокод для DICE_2 приведен ниже.

Алгоритм 1 Вычисление коэффициента кубиков ансамбля (DICE_2).

Здесь Q и P — наборы сегментированных объектов (ядер). Два коэффициента DICE были вычислены для каждого фрагмента изображения в тестовом наборе данных. Оценка плитки изображения рассчитывалась как среднее значение двух коэффициентов игральных костей.Оценка для всего набора тестовых данных была вычислена как среднее значение оценок всех фрагментов изображения.

Изображения и участки изображений для проблем были выбраны патологами, чтобы иметь репрезентативный набор случаев (например, относительно простые и более сложные случаи при сегментации). Создание вручную аннотированных точных наборов данных для обучения и тестирования является трудоемкой работой и требует привлечения патологоанатомов, время которых ограничено и дорого. Таким образом, такие наборы данных относительно небольшие.Несмотря на то, что в последнее время существует несколько подходов к созданию синтетических наборов данных (например, Hou et al., 2017; Mahmood et al., 2018), аннотированные вручную наборы данных продолжают представлять золотой стандарт данных для обучения и тестирования, а нехватка больших, вручную аннотированные наборы данных остаются реальностью. Следовательно, это представляет собой еще одну проблему, которую должны решать автоматизированные алгоритмы. Одним из ограничений относительно небольших наборов данных для обучения и тестирования является то, что они не могут полностью улавливать пакетные эффекты.

Классификация изображений целых слайдов

В этой подзадаче использовались изображения из случаев NSCLC.Все изображения были также получены из изображений целых слайдов ткани в репозитории TCGA. Каждое полное изображение ткани на слайде, хранящееся в репозитории TCGA, содержит диагностическую информацию о категории раковой опухоли (например, gbm, lgg, яичник), а также соответствующие данные о клинических исходах и данные геномики. Изображения были просмотрены и выбраны патологом. В случаях NSCLC изображения были выбраны из случаев NSCLC адено (LUAD) и плоскоклеточного NSCLC (LUSC). У каждого случая в наборе данных было одно изображение, поэтому классификация изображений соответствовала классификации случаев.Участникам испытания было предложено применить свои алгоритмы для классификации каждого изображения как аденоидного NSCLC или плоскоклеточного NSCLS. В наборе обучающих данных было всего 32 случая; 16 случаев LUAD и 16 случаев LUSC. В наборе тестовых данных было всего 32 случая с 16 случаями LUAD и 16 случаями LUSC. Изображения были доступны в исходном формате файла (например, в формате Aperio svs). Исходное имя файла TCGA каждого изображения было сопоставлено с общим именем файла (например, image1.svs, image2.svs и т. Д.). Изображение метки и метаданные изображения, показывающие идентификатор случая TCGA, были удалены из файлов изображений.Абсолютная правда была предоставлена ​​для обучающих изображений, которые дали тип рака для каждого WSI, в то время как эта основная правда была сохранена для тестовых изображений. Оценка алгоритма анализа рассчитывалась как количество правильно классифицированных случаев, деленное на общее количество случаев.

Экспериментальная оценка метода глубокого обучения для сегментации ядер

Из исходных 32 фрагментов обучающего образа без дополнительных шагов предварительной обработки извлекается несколько фрагментов (~ 100 на изображение) размером 200 × 200.Генерируются три набора обучающих данных (Таблица 2). Путем сдвига окна с шагом 54 пикселя и случайного кадрирования генерируется 4732 фрагмента, которые обозначаются как набор данных Nuclei Blob (NBL) и используются для обнаружения ядерных blob. Набор данных Nuclei Boundary (NBD) создается путем центрирования каждого ядра в центре каждого фрагмента, в результате чего получается 2785 фрагментов, которые используются для обнаружения границ ядер. Набор данных Small Nuclei (SN) — это дублированный набор данных NBL, который содержит только пятна с ядрами, содержащие ≤ 50% ядер пикселей.Набор данных SN используется только для обучения DRAN обнаружению ядерных блобов.

Таблица 2 . Генерация трех наборов данных из исходных 32 фрагментов изображений.

Во время обучения увеличение данных применяется следующим образом: (1) случайный вертикальный и горизонтальный сдвиг в диапазоне [-0,05, 0,05] с учетом ширины и высоты пятна (2) случайное вращение в диапазоне [- 45 °, 45 °] градусов (3) случайный вертикальный и горизонтальный переворот с вероятностью 0,5 (4) случайный сдвиг с интенсивностью в диапазоне [-0.4π, 0,4π] (5) случайное изменение размера с соотношением в диапазоне [0,6, 2,0]. Это увеличение предназначено для устранения вариаций ядер по контрасту, форме и т. Д., Которые часто наблюдаются на изображениях патологии. Известно, что это помогает справиться с естественными вариациями, присутствующими на изображениях, а также обеспечивает надежность сети (Ronneberger et al., 2015). После увеличения центральная область размером 102 × 102 извлекается перед подачей в сеть (Рисунок 6). Увеличение проводится 3 раза на пластырь.

Рисунок 6 . Генерация патча изображения. Чтобы избежать заполнения нулями при увеличении, сначала предоставляется заплатка размером 200 × 200. Затем центральная область 102 × 102 обрезается и вводится в сеть в качестве входных данных. Для входа размером 102 × 102 сеть предоставляет карту сегментации размером 54 × 54.

Используя сгенерированные выше данные обучения, DRAN обучается с помощью оптимизатора Adam со значениями параметров по умолчанию (β1 = 0,9, β2 = 0,999, ϵ = 1e-8). Размер мини-партии 32 поддерживается на протяжении всего тренировочного процесса.Потеря регуляризации L2 также применяется с коэффициентом 1,0e-5 для улучшения обобщаемости предлагаемой сети. K. He initialization (He et al., 2015) используется для инициализации весов сверточных слоев на пути расширения. Обучение проходит в два этапа. На первой фазе (35 эпох) предварительно обученные веса предварительно активированного ResNet50 загружаются в сокращающийся путь и остаются замороженными (без обновления весов), то есть на этой фазе обучается только расширяющийся путь.Скорость обучения изначально установлена ​​на 1.0e-4, затем изменяется на 5.0e-5, 1.0e-5, 7.5e-6 и 5.0e-6 в 0-ю, 1-ю, 15-ю, 25-ю и 35-ю эпохи соответственно. . На этом этапе сеть обучается с использованием набора данных NBL для обнаружения блобов ядер и набора данных NBD для обнаружения границ ядер. На втором этапе (40 эпох) сокращающийся путь размораживается, то есть вся сеть становится обучаемой. Для обнаружения ядер-капель используются наборы данных NBL и SN для дальнейшего уточнения сети. Для обнаружения границ ядер используется только набор данных NBD.Кроме того, различные штрафы за функцию потерь налагаются, чтобы уменьшить сильную систематическую ошибку в наборе данных NBD; каждый граничный пиксель имеет вес 5,0, а неверно классифицированный граничный пиксель, поскольку фон получает вес 6.0. Фоновые пиксели имеют вес 1,0, а их неправильная классификация наказывается 4,0.

С другой стороны, с теми же данными обучения, что и DRAN, процедура обучения многомасштабной модели подробно описана следующим образом: каждая ветвь DRAN MDRAN загружается предварительно обученными весами DRAN, которые получены из процедуры, описанной выше, и сохраняются замороженный.Затем сеть переходит к обучению декодера4 за 10 эпох со скоростью обучения 1.0e-4. После этого расширяющийся путь DRAN размораживается и настраивается на дополнительные 35 эпох, в то время как скорость обучения устанавливается равной 1.0e-4, 1.0e-5 и 1.0e-6 в 1-ю, 15-ю и 30-ю эпохи, соответственно.

В целом, с использованием набора данных NBL + SN, MDRAN _BL был обучен обнаружению ядерных блобов. DRAN _BD был обучен на наборе данных NBD для обнаружения границ ядер.Объединив две модели (MDRAN _BL + DRAN _BD ), была выполнена сегментация ядер. В таблице 3 показаны результаты сегментации тестового набора. Наш метод (MDRAN _BL + DRAN _BD ) показал 0,862 DICE_1, 0,703 DICE_2 и средний балл 0,783. Был исследован эффект многомасштабной агрегации (MDRAN _BL ). Используя метод сегментации ядер по единой шкале (DRAN _BL + DRAN _BD ), мы получили 0,853 DICE_1, 0,701 DICE_2 и средний балл 0.777, хуже, чем у многомасштабной агрегации. При прямом сравнении тестового набора многомасштабная агрегация существенно улучшила производительность сегментации, особенно на трех тестовых изображениях, сканированных с 20-кратным увеличением (рис. 7). Что касается других тестовых изображений, отсканированных с 40-кратным увеличением, многомасштабная агрегация в целом немного превосходит метод единого масштаба. Это говорит о том, что многомасштабная агрегация, в частности, помогает улучшить сегментацию (относительно) более мелких ядер.На рисунке 8 показаны результаты сегментации с помощью метода многомасштабной агрегации и единой шкалы; Одномасштабный метод пропустил несколько небольших ядер, которые, однако, были идентифицированы многомасштабной агрегацией.

Таблица 3 . Сегментация производительности ядер.

Рисунок 7 . Прямое сравнение между MDRAN _BL и DRAN _BL на испытательном наборе. Тестовые изображения отсортированы в порядке возрастания MDRAN DICE_1.Заштрихованная область указывает на то, что изображения были отсканированы с 20-кратным увеличением.

Рисунок 8 . Примеры сегментации ядер с помощью многомасштабной агрегации (MDRAN _BL + DRAN _BD ) и одномасштабного подхода (DRAN _BL + DRAN _BD ). Изображения сверху вниз являются 1-м, 11-м, 20-м и 25-м фрагментом изображения в тестовом наборе.

Примечательно, что огромное расхождение между DICE_1 и DICE_2 наблюдалось для нескольких тестовых изображений (Рисунок 7).При более внимательном рассмотрении мы обнаружили, что это в основном связано с изменчивостью и нестабильностью окрашивания, а также с плотно перекрывающимися ядрами. Как показано на рисунке 9, границы идентифицированных ядер часто фрагментированы и несовершенны, что приводит к неточной сегментации перекрывающихся ядер. Это указывает на то, что усовершенствованный и сложный метод разделения ядер путем прикосновения может иметь большой потенциал для улучшения характеристик сегментации.

Рисунок 9 . Примеры правильной и неправильной сегментации ядер.Наш метод (внизу) позволяет достаточно хорошо различать границы неперекрывающихся ядер, но (вверху) не работает на сильно перекрывающихся ядрах с непропорциональными пятнами.

Классификация полных слайд-изображений

Мы использовали в общей сложности 64 WSI НМРЛ с гематоксилином и эозином (H&E), которые были разделены на 32 обучающих и 32 тестовых изображения. У нас была равномерная разбивка изображений NSCLC как в тренировочном, так и в тестовом наборе, что дало в общей сложности 32 слайда LUAD и 32 слайда LUSC.Мы разделили наш набор данных так, чтобы у нас было 24 WSI для обучения и 8 для проверки, с 4 проверочными изображениями, взятыми из LUAD и LUSC соответственно. Мы извлекли набор данных трех классов, состоящий из пятен размером 256 × 256 при 20-кратном увеличении, из неполных помеченных областей, подтвержденных экспертом-патологом (AK). Этот 3-х классный набор данных состоял из LUAD, LUSC и недиагностических областей (ND). Диагностические области LUAD на слайде состояли из: опухоли; структуры структуры роста и строма опухоли. Диагностические области LUSC включали: опухоль; кератиновый жемчуг и строма опухоли.К недиагностическим областям относились: жир; лимфоциты; кровеносный сосуд; альвеолы; красные кровяные тельца; нормальная строма; хрящ и некроз. Мы считали некроз недиагностическим, потому что, несмотря на то, что LUSC обычно имеет больше некротических областей, чем LUAD, он не свидетельствует о плоскоклеточной карциноме легкого на индивидуальной основе. В этом случае было особенно важно включить недиагностические области, поскольку в наборе данных не было нормальных случаев. В целом наша сеть оптимизирована на 65 788 исправлениях обучающих образов.

Между всеми изображениями наблюдался высокий уровень вариации пятен из-за того, что изображения были получены из разных центров. Чтобы противостоять этой изменчивости окраски, мы применили Reinhard et al. (2001) окрашивают нормализацию для всех изображений путем сопоставления каждого изображения со статистикой заранее определенного целевого изображения. Во время обучения мы выполнили случайное увеличение данных кадрирования, переворота и поворота, чтобы сделать сеть инвариантной для этих преобразований. После выполнения случайного кадрирования для всех входных патчей у нас остался патч размером 224 × 224.

Увеличение количества помеченных данных в сочетании с резким увеличением вычислительной мощности позволило глубоким сверточным нейронным сетям достичь высочайшего уровня производительности в задачах компьютерного зрения. Иерархическая архитектура таких сетей позволяет им иметь сильную репрезентативную силу, когда сложность изученных функций увеличивается с увеличением глубины сети. Предлагаемая сеть f представляет собой композицию последовательности из L функций слоев ( f ₁ ,…, f _L ), которая отображает входной вектор x на выходной вектор. и , п.е.,

, где w _L — вектор веса и смещения для L ^th слой f _L . На практике f _L чаще всего выполняет одну из следующих операций: (а) свертка с набором фильтров; (б) пространственное объединение; и (c) нелинейная активация.

Дан набор обучающих данных { ( x ^{( i )} , y ^{( i )} ) } , где i находится в диапазоне от 1 до N .Мы можем оценить векторы w ₁ … w _L , решив:

, где l — определенная функция потерь.Мы выполняем численную оптимизацию (2) традиционно с помощью алгоритма обратного распространения и методов стохастического градиентного спуска.

В дополнение к вышеуказанным операциям недавно были предложены остаточные сети (ResNets) (He et al., 2016b), которые позволяют обучать сети глубже и, как следствие, получать выгоду от большей точности. Современные сети (Simonyan, Zisserman, 2014; Szegedy et al., 2015; He et al., 2016b; Huang et al., 2017) показывают, что глубина сети имеет решающее значение, но в пределах традиционных CNN, точность становится насыщенной, а затем быстро ухудшается по мере того, как глубина становится значительно большей.Интуиция, лежащая в основе остаточной сети, заключается в том, что проще оптимизировать остаточное отображение, чем оптимизировать исходное отображение без ссылок. Остаточные блоки являются основными компонентами ResNet и состоят из пропускаемого соединения с прямой связью, которое выполняет сопоставление идентификаторов без добавления каких-либо дополнительных параметров. Эти соединения распространяют градиент по всей модели, что, в свою очередь, позволяет обучать сеть глубже, часто достигая большей точности.

Таблица 4 суммирует эксперименты, которые мы провели для классификации входных патчей на LUAD, LUSC и ND.Мы выбираем для обучения указанные сети из-за их высокой производительности в недавних задачах распознавания изображений (Deng et al., 2009). Во время обучения все сети быстро подходят к обучающим данным. Это произошло по двум причинам: (i) используемые сетевые архитектуры были оптимизированы для крупномасштабных задач компьютерного зрения с миллионами изображений и тысячами классов; (ii) У нас довольно ограниченный размер обучающей выборки. Из-за размера нашего набора данных, (iii) трудно избежать чрезмерной подгонки, учитывая достаточное количество параметров модели.Поэтому мы модифицируем сетевую архитектуру, чтобы противостоять проблеме чрезмерной подгонки за счет уменьшения количества слоев. Мы вносим изменения в исходную реализацию ResNet, уменьшая количество остаточных единиц, так что у нас есть всего 32 слоя в модели. Модификация ResNet50 для предоставления ResNet32 помогла решить проблему чрезмерной подгонки и обеспечила лучшую производительность на уровне исправлений. Несмотря на достижение только 0,4% большей точности, чем InceptionV3, ResNet32 привел к значительно более высокой средней точности на уровне патчей LUAD и LUSC.Средняя точность уровня исправлений LUAD и LUSC для InceptionV3 составила 0,678, тогда как средняя точность для ResNet32 составила 0,776. Вследствие превосходной производительности на уровне исправлений мы решили использовать ResNet32 для обработки изображений в тестовом наборе. На рисунке 10 показаны четыре тестовых WSI с наложенными на них картами вероятностей. Зеленые области показывают области, классифицированные как LUSC, синие / фиолетовые области показывают области, классифицированные как LUAD, а желтые / оранжевые области показывают области, классифицированные как ND.

Таблица 4 .Точность на уровне патча.

Рисунок 10 . Тестируйте WSI с наложенными картами вероятностей. Синий / фиолетовый указывает на область, классифицированную как диагностическая LUAD, зеленый цвет указывает на область, классифицированную как диагностическую LUSC, желтый / оранжевый относится к области, классифицированной как недиагностическая.

Таблица 5 показывает общую точность классификации NSCLC WSI, обработанную организаторами задачи. Мы наблюдаем, что использование модели регрессии случайного леса со статистическими и морфологическими признаками из помеченного WSI повышает точность классификации.Максимального количества голосов достаточно, когда LUAD или LUSC являются доминирующим классом в помеченном WSI, но когда нет очевидного доминирующего класса, модель регрессии случайного леса увеличивает производительность. Это связано с тем, что функции, используемые в качестве входных данных для модели случайного леса, более информативны, чем простое использование схемы голосования, и поэтому могут лучше различать каждый тип рака.

Таблица 5 . Общая точность классификации WSI.

Предложенный метод обеспечивает хорошую точность с оценкой 0.81. Учитывая ограниченность набора данных, ясно, что классификация НМРЛ WSI на диагностические и недиагностические области имеет решающее значение. Это особенно важно для данной конкретной реализации, поскольку обучающий набор не содержал нормальных случаев. Без учета недиагностических областей алгоритм был бы вынужден делать прогноз для неинформативных фрагментов изображения. Кроме того, очевидно, что анализ морфологии классифицированных областей может расширить возможности классификации всего изображения слайда и превосходит метод максимального голосования.Учет контекстной информации может оказать дополнительную помощь в задачах классификации в рамках вычислительной патологии (Agarwalla et al., 2017; Bejnordi et al., 2017). Например, характер роста в случаях LUAD и то, как опухоль растет вместе со стромой, имеет большое значение при классификации случаев NSCLC. Эти паттерны часто очень трудно визуализировать в патче 224 × 224 при разрешении 20 ×. В будущей работе разработка предлагаемой нами сети для точного включения большего количества контекстной информации может улучшить точность на уровне заплат и, следовательно, общую точность классификации.Для развития этой работы мы также стремимся использовать больший набор данных, чтобы наш классификатор на уровне патчей мог извлекать более характерные признаки для последующей классификации NSCLC.

Обсуждение

Понимание взаимосвязи между морфологией и молекулярными механизмами — центральный компонент исследований сложных заболеваний, в частности рака. Например, существуют скрытые и наблюдаемые изменения в структуре и функциях тканей в начале рака и в ходе его прогрессирования.Традиционно целые ткани предметных стекол исследуются вручную под мощным световым микроскопом для постановки диагноза. Этот ручной процесс трудоемок и ограничивает количество образцов тканей, которые можно использовать в исследовании. Цифровая патология позволяет проводить количественные исследования этих изменений и механизмов основного заболевания на субклеточных уровнях. Интеграция информации, полученной в результате анализа данных визуализации патологии, в ландшафт всего спектра клинической информации может помочь получить информацию как по конкретному заболеванию, так и по пациенту, которая может использоваться для ускорения проведения исследований рака с высокой степенью риска и высокой награды для получения лучших результатов.

В последние годы методы глубокого обучения вызвали большой интерес в сообществах компьютерного зрения и анализа изображений. Они показали превосходную производительность по сравнению с методами на основе статистики и другими методами машинного обучения в различных задачах анализа изображений. В области цифровой патологии растет число конвейеров анализа на основе глубокого обучения. В этой статье мы представили два новых конвейера для анализа изображений тканей. Эти методы нацелены на два основных этапа анализа изображений тканей; сегментация ядер / клеток и классификация изображений.Многомасштабная сеть глубокой остаточной агрегации предназначена для сегментации ядер на изображениях. Экспериментальная оценка показывает, что (1) многомасштабная агрегация помогает улучшить сегментацию (относительно) более мелких ядер и (2) передовые и сложные методы разделения ядер путем прикосновения могут иметь большой потенциал для улучшения характеристик сегментации в образцах тканей с заметными вариациями окраски. и нестабильность, а также плотно перекрывающиеся ядра. Второй метод реализует глубокую нейронную сеть, которая классифицирует участки изображения в изображениях целых слайдов образцов ткани немелкоклеточного рака легкого как аденокарциному легкого, плоскоклеточный рак легкого или недиагностические области.Результаты экспериментов показывают, что использование сети глубокого обучения и модели случайной регрессии леса, в которой используются статистические и морфологические признаки, извлеченные из изображений, может обеспечить хорошую точность классификации.

Хотя методы, представленные в этой и других работах, продемонстрировали многообещающие результаты, существует несколько других соображений и проблем при разработке таких методов и интеграции информации, полученной с помощью методов автоматической сегментации и классификации, в исследовательские и клинические рабочие процессы.Участие человека по-прежнему является важным компонентом эффективного применения глубокого обучения и других автоматизированных методов в биомедицинском анализе изображений. Экспертная оценка результатов анализа изображений людьми важна не только для оценки качества и интерпретации результатов анализа, но также для итеративного или активного улучшения моделей сегментации и классификации (и получения более точных и надежных результатов) (Holzinger, 2016; Holzinger et al. , 2018). Одна из проблем, с которыми сталкивается человек при анализе изображений патологии, — это огромный объем данных.Полное изображение ткани на слайде может содержать более одного миллиона ядер и сотни тысяч участков изображения. Даже исследовательский проект среднего размера с тысячами изображений может генерировать очень большой объем данных классификации и сегментации. Эксперты-люди не могут проанализировать эти данные для контроля качества и улучшения итерационных моделей. В некоторых недавних проектах (например, Beluch et al., 2018) рассматриваются методы глубокого обучения для снижения затрат на интерактивную / итеративную маркировку.Эти методы нацелены на оценку неопределенности результатов анализа и разумный выбор подмножеств данных для уменьшения количества итераций при достижении определенного уровня точности анализа. В некоторых проектах (например, Wen et al., 2017) изучается использование методов машинного обучения для помощи в оценке качества результатов анализа, полученных с помощью автоматизированных методов. Мы считаем, что интегрированные подходы, сочетающие методы глубокого / машинного обучения для анализа с методами глубокого / машинного обучения для оценки качества и выбора данных для итеративного уточнения модели, обеспечат эффективную платформу для анализа изображений патологии.Эти методы облегчат применение знаний эксперта-человека для улучшения результатов анализа при одновременном снижении ручной нагрузки на эксперта-человека.

Более сложная задача — объяснимость моделей глубокого обучения. В большинстве случаев методы глубокого обучения рассматриваются как черные ящики. Несмотря на то, что были разработаны некоторые математические основы глубокого обучения, объяснение того, как модель глубокого обучения пришла к определенному решению, остается открытой проблемой. Мы ожидаем, что объяснимость будет все больше и больше становиться центральной проблемой для более глубокой интеграции глубокого обучения и других автоматизированных методов в клинических условиях.Эта относительно новая тема машинного / глубокого обучения в биомедицине быстро набирает популярность; в последнее время появляется все больше работ по определению объяснимого ИИ и поиску подходов к его реализации (Došilović et al., 2018; Holzinger, 2018; Sadeghi et al., 2018).

Еще одним важным фактором при разработке более точных и надежных автоматизированных методов является систематическая оценка различных стратегий и вкладов различных исследовательских групп. Мы утверждаем, что повышение точности, надежности и эффективности методов и конвейеров анализа цифровых изображений патологии будет ускорено за счет привлечения сообщества разработчиков методов.В этой связи решающую роль играют задачи анализа изображений, такие как «Вызов компьютерной прецизионной медицины в области цифровой патологии», проведенный на конференции MICCAI 2017.

Как мы представили в этой статье с помощью двух новых подходов, методы глубокого обучения улучшают производительность прогнозирования и лучше справляются с относительно небольшими наборами обучающих данных. Однако не существует универсальных решений, и эффективная интеграция человеческих экспертных знаний для уточнения моделей, контроля качества и интерпретации / объяснения очень важна для более эффективного применения методов глубокого обучения в биомедицинских исследованиях.

Доступность данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Авторские взносы

QV, MT и JK предложили, реализовали и оценили метод глубокого обучения для алгоритма сегментации ядра в разделе Сегментация ядер методом глубокого обучения. SG, MS, TQ, NK, SK и NR предложили, внедрили и оценили двухэтапный метод для классификации тканей целых слайдов в разделе «Классификация целых изображений слайдов с помощью двухкомпонентного автоматического метода».KF, TK, JK-C и JS являются основными организаторами конкурса MICCAI 2017 Digital Pathology Challenge. TK, JS, TZ и RG собрали воедино наборы данных задачи, контролировали генерацию наземных данных и разработали метод оценки индекса ансамбля кубиков. Все авторы внесли текст в рукопись и отредактировали ее.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIP) (№ 2016R1C1B2012433), частично 1U24CA180924-01A1 из Национального института рака, R01LM011119-01 и R01LM009239 из США. .С. Национальная медицинская библиотека.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Агарвалла, А., Шабан, М., и Раджпут, Н. М. (2017). Сети представления-агрегирования для сегментации мультигигапиксельных гистологических изображений. arXiv препринт arXiv: 1707.08814.

Google Scholar

Аль-Миладжи, З., Эрсой, И., Хафиане, А., Паланиаппан, К., и Буняк, Ф. (2017). Интеграция сегментирования с глубоким обучением для улучшенной классификации эпителиальных и стромальных тканей на изображениях H&E. Распознавание образов. Lett. 119, 214–221. DOI: 10.1016 / j.patrec.2017.09.015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бадринараян В., Кендалл А. и Чиполла Р. (2017). SegNet: архитектура глубокого сверточного кодировщика-декодера для сегментации изображений. IEEE Trans.Pattern Anal. Мах. Интел . 1, 2481–2495. DOI: 10.1109 / TPAMI.2016.2644615

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bejnordi, B.E., Zuidhof, G.C.A., Balkenhol, M., Hermsen, M., Bult, P., van Ginneken, B., et al. (2017). Сложенные сверточные нейронные сети с учетом контекста для классификации карцином молочной железы на полных гистопатологических изображениях. J. Med. Представь. 4: 044504. DOI: 10.1117 / 1.JMI.4.4.044504 ​​

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Белух, В.Х., Геневайн, Т., Нюрнбергер, А., Кёлер, Дж. М. (2018). «Сила ансамблей для активного обучения в классификации изображений», в Proceedings of the IEEE Conference on Computer Vision and Pattern, Recognition (Salt Lake City, UT), 9368–9377. DOI: 10.1109 / CVPR.2018.00976

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chen, H., Qi, X., Yu, L., Dou, Q., Qin, J., and Heng, P.-A. (2017). DCAN: сети с глубокими контурами для сегментации экземпляров объектов из гистологических изображений. Мед . Изображение Анал . 36, 135–146. DOI: 10.1016 / j.media.2016.11.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ченнубхотла, К., Кларк, Л. П., Федоров, А., Форан, Д., Харрис, Г., Хелтон, Э. и др. (2017). Оценка информатики изображений для точной медицины рака. Ежегодник Мед. Информатика 26, 110–119. DOI: 10.15265 / IY-2017-041

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купер, Л.А., Демикко, Э. Г., Сальц, Дж. Х., Пауэлл, Р. Т., Рао, А., и Лазар, А. Дж. (2018). Выводы PanCancer из Атласа генома рака: взгляд патолога. Дж. Патол . 244, 512–524. DOI: 10.1002 / путь.5028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кудрей Н., Морейра А. Л., Сакелларопулос Т., Феньо Д., Разавиан Н. и Циригос А. (2018). Классификация и прогнозирование мутаций на основе изображений гистопатологии немелкоклеточного рака легкого с использованием глубокого обучения. Nat. Мед . 17: 5. DOI: 10.1038 / s41591-018-0177-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэн, Дж., Донг, В., Сочер, Р., Ли, Л.-Дж., Ли, К., и Фей-Фей, Л. (2009). ImageNet: крупномасштабная база данных иерархических изображений. IEEE Confer. Comput. Vis. Распознавание образов . 20, 248–255. DOI: 10.1109 / CVPR.2009.5206848

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дайс, Л. Р. (1945). Меры степени экологической связи между видами. Экология 26, 297–302. DOI: 10.2307 / 1932409

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дошилович, Ф. К., Брчич, М., и Хлупич, Н. (2018). Объяснимый искусственный интеллект: опрос. IEEE 2018 41-й межд. Конвенция Информ. Commun. Technol. Электрон. Микроэлектрон. 21, 210–215. DOI: 10.23919 / MIPRO.2018.8400040

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Газнави Ф., Эванс А., Мадабхуши А. и Фельдман М. (2013). Цифровая визуализация в патологии: визуализация всего слайда и не только. Ann. Преподобный Патол. 8, 331–359. DOI: 10.1146 / annurev-pathol-011811-120902

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грэм, С., и Раджпут, Н. (2018). «SAMS-Net: многомасштабная сеть с распознаванием пятен для сегментации ядер на основе экземпляров в гистологических изображениях», в Biomedical Imaging (ISBI 2018), 15-й Международный симпозиум IEEE 2018 г. IEEE (Вашингтон, округ Колумбия), 590–594. DOI: 10.1109 / ISBI.2018.8363645

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гуркан, М.Н., Бушерон Л. Э., Джан А., Мадабхуши А., Раджпут Н. и Йенер Б. (2009). Гистопатологический анализ изображений: обзор. IEEE Rev. Biomed. Англ. 2: 147. DOI: 10.1109 / RBME.2009.2034865

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харихаран Б., Арбелаэз П., Гиршик Р. и Малик Дж. (2015). «Гиперстолбцы для сегментации объектов и детальной локализации», в Proceedings of the IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (Boston, MA), 447–456.DOI: 10.1109 / CVPR.2015.7298642

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хе К., Чжан Х., Рен С. и Сун Дж. (2015). «Углубляясь в выпрямители: превосходя характеристики человеческого уровня по классификации изображений», в материалах Proceedings of the IEEE International Conference on Computer Vision (Santiago), 1026–1034. DOI: 10.1109 / ICCV.2015.123

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хе К., Чжан Х., Рен С. и Сунь Дж. (2016a).«Отображения идентичности в глубоких остаточных сетях», в European Conference on Computer Vision (Cham: Springer), 630–645. DOI: 10.1007 / 978-3-319-46493-0_38

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хе К., Чжан Х., Рен С. и Сун Дж. (2016b). «Глубокое остаточное обучение для распознавания изображений», в материалах Proceedings of the IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (Amsterdam), 770–778. DOI: 10.1109 / CVPR.2016.90

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хольцингер, А.(2018). От машинного обучения к объяснимому ИИ. Всемирный симпозиум IEEE 2018 Digital Intell. Syst. Мах. 23, 55–66. DOI: 10.1109 / DISA.2018.84

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Holzinger, A., Plass, M., Kickmeier-Rust, M., Holzinger, K., Crişan, G.C., Pintea, C.M., et al. (2018). Интерактивное машинное обучение: экспериментальные данные для человека в алгоритмическом цикле. Заявл. Intell. 7, 1–4. DOI: 10.1007 / s10489-018-1361-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоу, Л., Агарвал, А., Самарас, Д., Курч, Т. М., Гупта, Р. Р., и Сальц, Дж. Х. (2017). Неконтролируемый синтез изображений гистопатологии. arXiv arXiv: 1712.05021.

Google Scholar

Hou, L., Samaras, D., Kurc, T. M., Gao, Y., Davis, J. E., and Saltz, J.H. (2016). «Сверточная нейронная сеть на основе патчей для классификации изображений всей ткани на слайде», в материалах Proceedings of the IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (Las Vegas, NV), 2424–2433.DOI: 10.1109 / CVPR.2016.266

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг, Г., Лю, З., ван дер Маатен, Л., и Вайнбергер, К. К. (2017). «Плотно связанные сверточные сети» в протоколе Proceedings of the IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (Honolulu, HI). DOI: 10.1109 / CVPR.2017.243

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кахья, М. А., Аль-Хаяни, В., и Альгамал, З. Ю. (2017). Классификация изображений гистопатологии рака молочной железы на основе адаптивного вектора разреженной поддержки. J. Appl. Математика. Биоинформатика 7:49.

Google Scholar

Лонг, Дж., Шелхамер, Э., Даррелл, Т. (2015). «Полностью сверточные сети для семантической сегментации» в Proceedings of the IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (Boston, MA), 3431–3440. DOI: 10.1109 / CVPR.2015.7298965

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Махмуд, Ф., Бордерс, Д., Чен, Р., Маккей, Г. Н., Салимиан, К. Дж., Барас, А. и др.(2018). Глубокая состязательная тренировка для сегментации многоорганных ядер в гистопатологических изображениях. arXiv arXiv: 1810.00236.

Google Scholar

Маниваннан, С., Ли, В., Акбар, С., Ван, Р., Чжан, Дж., И Маккенна, С. (2016). Автоматическая система распознавания образов для классификации непрямых иммунофлуоресцентных изображений клеток и образцов гепатита 2. Распознавание образов . 51, 12–26. DOI: 10.1016 / j.patcog.2015.09.015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пейкари, М., и Мартель, А. Л. (2016). «Автоматическое обнаружение и сегментация клеток на предметных стеклах с патологией, окрашенными H и E, с использованием растяжения декорреляции цветового пространства», в Medical Imaging 2016: Digital Pathology. Международное общество оптики и фотоники (Сан-Диего, Калифорния), 9791: 979114.

Google Scholar

Пейкари, М., Салама, С., Нофек-Мозес, С., и Мартель, А.Л. (2018). Полуконтролируемый подход к обучению с кластеризацией и маркировкой для классификации изображений патологии.

Биология — ткани животных | askIITians

• Структурная организация растений и животных

• ПРЕДЛАГАЕМАЯ ЦЕНА: рупий.477

• Просмотр подробностей

Структура клеток различается в зависимости от их функции.Таким образом, ткани разные и в целом подразделяются на четыре типа:

(i) Эпителиальный,

(ii) Соединительный элемент,

(iii) мышечная и

(iv) Нейронный

Виды тканей

По назначению и расположению ткани бывают четырех типов:

(1) Эпителиальная ткань

• Ткань имеет свободную поверхность, которая обращена либо к жидкости организма, либо к внешней среде и, таким образом, обеспечивает покрытие или подкладку для некоторой части тела.Клетки компактно упакованы небольшим межклеточным матриксом.

• Существует два типа эпителиальных тканей, а именно простой эпителий и сложный эпителий. Простой эпителий состоит из одного слоя клеток и функционирует как выстилка для полостей тела, протоков и трубок. Сложный эпителий состоит из двух или более слоев клеток и выполняет защитную функцию, как и наша кожа.

• На основании структурной модификации клеток простой эпителий делится на три типа.Это

(i) чешуйчатая, (ii) кубовидная, (iii) столбчатая.

• Плоский эпителий состоит из одного тонкого слоя уплощенных клеток с неправильными границами. Они находятся в стенках кровеносных сосудов и воздушных мешочках легких и участвуют в таких функциях, как формирование границы диффузии.

• Кубовидный эпителий состоит из одного слоя кубовидных клеток.Это обычно обнаруживается в протоках желез и трубчатых частях нефронов в почках, и его основные функции — секреция и абсорбция. Эпителий проксимального извитого канальца (ПКТ) нефрона в почке имеет микроворсинки.

• Столбчатый эпителий состоит из одного слоя высоких и тонких клеток. Их ядра расположены в основании. На свободной поверхности могут быть микроворсинки. Они находятся в слизистой оболочке желудка и кишечника и способствуют секреции и абсорбции.Если столбчатые или кубовидные клетки несут реснички на своей свободной поверхности, их называют мерцательным эпителием. Их функция заключается в перемещении частиц или слизи в определенном направлении по эпителию. В основном они присутствуют на внутренней поверхности полых органов, таких как бронхиолы и маточные трубы.

• Некоторые из столбчатых или кубовидных клеток специализируются на секреции и называются железистым эпителием. В основном они бывают двух типов: одноклеточные, состоящие из изолированных железистых клеток (бокаловидные клетки пищеварительного тракта), и многоклеточные, состоящие из скопления клеток (слюнные железы).

• Составной эпителий состоит из более чем одного слоя (многослойного) клеток и, таким образом, играет ограниченную роль в секреции и абсорбции. Их основная функция — защита от химических и механических воздействий. Они покрывают сухую поверхность кожи, влажную поверхность ротовой полости, глотки, внутреннюю оболочку протоков слюнных желез и протоков поджелудочной железы.

Эпителиальные ткани подразделяются на:

(a) Многослойный плоский ороговевший эпителий:

Многослойный плоский эпителий характеризуется множеством слоев клеток с типичными плоскими плоскими клетками на свободной или внешней поверхности листа.Присутствие кератина в этих клетках способствует защитным свойствам кожи, покрывающей поверхность тела. Кератин мертвый и водостойкий, поэтому он защищает подлежащие ткани от истирания и инфекций, например. эпидермис кожи наземных позвоночных.

(b) Многослойный плоский неороговевший эпителий:

Его свободная поверхность влажная, а наружные эпителиальные клетки, в отличие от клеток кожи, не содержат кератина. Этот тип эпителия выполняет защитную функцию.Он обнаруживается в выстилке ротовой полости (ротовой полости), глотки, пищевода, анального канала, нижней части уретры, голосовых связок, влагалища, шейки матки (нижняя часть матки) и роговицы глаз.

(c) Многослойный столбчатый эпителий:

Это защитный эпителий, состоящий из нескольких слоев столбчатых клеток, только самые поверхностные клетки действительно столбчатые по внешнему виду. Эпителий этого типа встречается редко. Он обнаруживается в уретре у мужчин и в слизистом слое около заднего прохода.Он также выстилает протоки молочной железы и надгортанник.

(d) Переходный эпителий (уротелий):

Часто состоит из болот или более толстых слоев. Отсутствует прорастающий слой, базальная мембрана. Многослойный переходный эпителий обычно находится в таких областях тела, как стенка мочевого пузыря, мочеточника и почечной лоханки. Он расположен во всех полых внутренних органах, подвергающихся нагрузке, и защищает стенку органа от разрыва.

(e) Нейросенсорный эпителий:

Обонятельная слизистая оболочка, называемая шнейдеровской оболочкой, выстилка внутренних носовых ходов, сетчатка глаз и эпителиальный покров языка, содержащий вкусовые рецепторы, являются примерами нейросенсорного эпителия.Сенсорные клетки несут на своих свободных концах тонкие «сенсорные волоски» для получения определенных стимулов. В основном эти клетки связаны с помощью синапсов с тонкими волокнами сенсорных нервов.

(f) Пигментный эпителий:

Эпителиальные клетки базального слоя сетчатки содержат пигмент. Следовательно, этот слой часто называют пигментированным эпителием. Например, — Пигментированный слой сетчатки, радужки и кожи.

(г) Зародышевый эпителий:

• Специализированные кубовидные клетки, способные производить гаметы, как в гонадах.Зародышевый эпителий производит гаметы, например, яйцеклетки (женские гаметы) и сперматозоиды (мужские гаметы)

• Все клетки эпителия удерживаются вместе небольшим количеством межклеточного материала. Почти во всех тканях животных специализированные соединения обеспечивают как структурные, так и функциональные связи между отдельными клетками.

• В эпителии и других тканях обнаружены три типа клеточных соединений. Они называются плотными, прилегающими и щелевыми соединениями.

• Плотные соединения предотвращают утечку веществ через ткань.

• Адгезивные соединения выполняют цементирование, чтобы соседние ячейки удерживались вместе.

• Щелевые соединения позволяют клеткам общаться друг с другом, соединяя цитоплазму соседних клеток, обеспечивая быстрый перенос ионов, небольших молекул, а иногда и больших молекул.

(2) Соединительная ткань

• Соединительные ткани наиболее многочисленны и широко распространены в организме сложных животных.

• Их называют соединительными тканями из-за их особой функции связывания и поддержки других тканей / органов тела.

• Они варьируются от мягких соединительных тканей до специализированных типов, которые включают хрящи, кости, жировую ткань и кровь.

• Во всех соединительных тканях, кроме крови, клетки выделяют волокна структурных белков, называемых коллагеном или эластином.

• Волокна придают ткани прочность, эластичность и гибкость.

• Эти клетки также секретируют модифицированные полисахариды, которые накапливаются между клетками и волокнами и действуют как матрица (основное вещество).

• Соединительные ткани подразделяются на три типа:

(i) Рыхлая соединительная ткань,

(ii) Плотная соединительная ткань и

(iii) Специализированная соединительная ткань.

• Рыхлая соединительная ткань содержит клетки и волокна, свободно расположенные в полужидком основном веществе, например, в ареолярной ткани, находящейся под кожей. Часто он служит опорным каркасом для эпителия.

• Он содержит фибробласты (клетки, производящие и секретирующие волокна), макрофаги и тучные клетки.

• Жировая ткань — это еще один тип рыхлой соединительной ткани, расположенной в основном под кожей.Клетки этой ткани специализируются на хранении жиров. Излишки питательных веществ, которые не используются сразу, превращаются в жиры и хранятся в этих тканях.

• Волокна и фибробласты компактно упакованы в плотные соединительные ткани.

• Ориентация волокон показывает правильный или неправильный рисунок и называется плотной правильной и плотной неправильной тканью.

• В плотных регулярных соединительных тканях коллагеновые волокна расположены рядами между множеством параллельных пучков волокон.

• Сухожилия, которые прикрепляют скелетные мышцы к костям, и связки, которые прикрепляют одну кость к другой, являются примерами этой ткани.

• Плотная соединительная ткань неправильной формы содержит фибробласты и множество волокон (в основном коллагеновых), ориентированных по-разному. Эта ткань присутствует в коже.

(а) Коллагеновые волокна

• Это самый распространенный фиброзный элемент ареолярной и других соединительных тканей.Это длинные неразветвленные волокна растворимого и сияющего белка коллагена (тропоколлагена).

• Эти волокна обладают большей прочностью и обеспечивают максимальную прочность на разрыв. Эти бесцветные и гиалиновые волокна называются белыми, чтобы отличать их от желтых эластиновых волокон.

• Коллагеновый белок является наиболее распространенным белком организма, составляет 25% от общего белка организма.

• Коллагеновые волокна могут окрашиваться эозином.Когда волокна коллагена удаляются из ареолярной ткани, они становятся рыхлыми и эластичными. например Кость, хрящ, связка и сухожилие.

(б) Желтые эластиновые волокна

• Эти волокна, образованные из белка эластина, менее многочисленны, тоньше, разветвлены, анастомозируют и имеют бледно-желтый цвет.

• Они очень эластичны и остаются растянутыми из-за натяжения в ареолярной ткани, при разрыве на дразнящих препаратах они клубятся и скручиваются; вроде натянутые провода.

• Эластин, вероятно, самый устойчивый из всех белков организма к химическим изменениям. Тысячи «мумий» возрастом до сих пор не повреждены артериями благодаря хорошо сохранившимся эластиновым волокнам. Они орцеинофильные, окрашенные орсеином.

(c) Волокна ретикулина:

• Это тонкие, свободно разветвляющиеся и неэластичные волокна белка ретикулина, переплетенные между собой, образующие сети.

• Их очень много у эмбрионов, новорожденных, а также в заживляющих и регенерирующих ранах.

• В ареолярных тканях взрослых они в основном замещены коллагеновыми волокнами, но остаются в большом количестве в лимфоидных и кроветворных тканях, а также в строме поджелудочной железы, печени и т. Д.

• Они окрашены AgBr и AgNO. ₃ , поэтому их называют аргентофильными или аргирофильными.При кипении коллаген и ретикулярные волокна превращаются в клей.

(d) Желтая фиброзная ткань:

• Матрикс состоит из множества плотно упакованных желтых или эластиновых волокон, которые похожи на волокна ареолярной соединительной ткани, но толще их.

• Он эластичный и гибкий. Образует стенку кровеносных сосудов, легких; настоящие голосовые связки, трахея, капсула селезенки и бронхиолы.

• Он также образует лист в связках. Связка представляет собой модифицированную желтую эластичную волокнистую ткань, соединяющую кость с костью.

(e) Жировая ткань:

• Это модифицированная форма ареолярной ткани, состоящая из специализированных больших сферических жировых клеток (под кожей) или адипоцитов.

• Жировая ткань в основном действует как «пищевой резерв» или жировое депо для хранения и метаболизма липидов.Помимо этого, они также действуют как теплоизоляторы и амортизаторы давления, тяги и толкания.

(е) Белая фиброзная ткань:

• Это видоизмененная форма ареолярной ткани. В матриксе присутствуют только коллагеновые волокна, а клетки, в основном, представляют собой фибробласты, присутствующие в суставах между костями черепа и делающие их неподвижными, что также встречается в дерме высших млекопитающих.

• Хрящ, кости и кровь — это различные типы специализированных соединительных тканей.

• Межклеточный материал хряща прочный, податливый и устойчивый к сжатию. Клетки этой ткани (хондроциты) заключены в небольшие полости внутри секретируемого ими матрикса.

• Большинство хрящей у эмбрионов позвоночных заменены костями у взрослых. Хрящ присутствует в кончике носа, суставах наружного уха, между соседними костями конечностей позвоночника и кистей рук у взрослых.

• Кости состоят из твердого и не податливого основного вещества, богатого солями кальция и волокнами коллагена, которые придают костям прочность.

• Это основная ткань, обеспечивающая структурный каркас тела. Кости поддерживают и защищают более мягкие ткани и органы.

• Костные клетки (остеоциты) находятся в пространствах, называемых лакунами. Кости конечностей, такие как длинные кости ног, выполняют функции несения веса.

• Они также взаимодействуют со скелетными мышцами, прикрепленными к ним, чтобы вызывать движения. Костный мозг в некоторых костях является местом производства клеток крови.

(г) Надкостница:

• Это мембрана, которая образует оболочку вокруг кости.

• Надкостница состоит из двух отдельных слоев. Наружный слой состоит из тонкой белой волокнистой соединительной ткани. Внутренний слой состоит из остеобластов, остеобласты — это паукообразные костные клетки, также известные как костеобразующие клетки, поскольку они производят новые костные материалы.

(h) Матрица:

• Матрица состоит из белка, называемого оссеином.

  No related posts.