Задание 6. Рассмотрите и зарисуйте поверхностный аппарат клетки (рис. 4.).

Вопросы для самоконтроля.

1. Каковы основные положения клеточной теории? Современное состояние клеточной теории?

2. Как устроены про- и эукариотические клетки?

3. Что такое органеллы, какова их роль в клетке?

4. Что относится к клеточным включениям? Какова их роль?

5. В чем сходство и относительное различие между растительной и животной клеткой?

6. Какова молекулярная организация универсальной биологической мембраны?

7. Каковы функции ядра в клетке?

Тема 3

Читайте также:

«Устройство лупы и светового микроскопа»

Описание презентации по отдельным слайдам:

Лабораторная работа № 1 Тема: «Устройство лупы и светового микроскопа. Правила работы с ними. Рассматривание клеток с помощью лупы». Цель: Научиться работать с ручной и штативной лупой, а также со световым микроскопом. Ход работы: Изучить и описать ручную, штативную лупу. Изучить и описать световой микроскоп. Рассмотрите кусочки мякоти томата под лупой. Зарисуйте увиденное в тетрадь. Сделать вывод. Записать правила работы с микроскопом.

1. Изучить и описать ручную, штативную лупу. Устройство лупы. Лупа — самый простой увеличительный прибор. Главная его часть — увеличительное стекло, выпуклое с двух сторон и вставленное в оправу. Лупы бывают ручные и штативные  Лупа ручная (1) и штативная (2)

Ручная лупа увеличивает предметы в 2—20 раз. При работе её берут за рукоятку и приближают к предмету на такое расстояние, при котором изображение предмета наиболее чётко. Штативная лупа увеличивает предметы в 10—25 раз. В её оправу вставлены два увеличительных стекла, укреплённых на подставке — штативе. К штативу прикреплён предметный столик с отверстием и зеркалом.

2. Рассмотрите кусочки мякоти томата под лупой. Зарисуйте увиденное в тетрадь. Сделать вывод. Вывод: Мякоть плода помидора состоит из мельчайших крупинок. Изучив крупинки помидора с помощью увеличительного прибора лупы, мы пришли к выводу, что мякоть помидора состоит из клеток.

3. Изучить и описать световой микроскоп. Устройство светового микроскопа. С помощью лупы можно рассмотреть форму клеток. Для изучения их строения пользуются микроскопом (от греческих слов «микрос» — малый и «скопео» — смотрю). Световой микроскоп, может увеличивать изображение предметов до 3600 раз. В зрительную трубку, или тубус, этого микроскопа вставлены увеличительные стёкла (линзы). В верхнем конце тубуса находится окуляр (от латинского слова «окулус» — глаз), через который рассматривают различные объекты. Он состоит из оправы и двух увеличительных стёкол. На нижнем конце тубуса помещается объектив (от латинского слова «объектум» — предмет), состоящий из оправы и нескольких увеличительных стёкол.

Тубус прикреплён к штативу. К штативу прикреплён также предметный столик, в центре которого имеется отверстие и под ним зеркало. Пользуясь световым микроскопом, можно видеть изображение объекта, освещенного с помощью этого зеркала. Чтобы узнать, насколько увеличивается изображение при использовании микроскопа, надо умножить число, указанное на окуляре, на число, указанное на используемом объекте. Например, если окуляр даёт 10-кратное увеличение, а объектив — 20-кратное, то общее увеличение 10 х 20 = 200 раз.

4. Записать правила работы с микроскопом. Правила работы с микроскопом Поставьте микроскоп штативом к себе на расстоянии 5—10 см от края стола. В отверстие предметного столика направьте зеркалом свет. Поместите приготовленный препарат на предметный столик и закрепите предметное стекло зажимами. Пользуясь винтом, плавно опустите тубус так, чтобы нижний край объектива оказался на расстоянии 1—2 мм от препарата. В окуляр смотрите одним глазом, не закрывая и не зажмуривая другой. Глядя в окуляр, при помощи винтов медленно поднимайте тубус, пока не появится чёткое изображение предмета. После работы микроскоп уберите в футляр. Микроскоп — хрупкий и дорогой прибор: работать с ним надо аккуратно, строго следуя правилам.

Вывод. В ходе лабораторной работы, мы изучили устройство микроскопа и приёмы работы с ним. А также рассмотрели под лупой клетки помидора. Д/з Выучить правила работы с микроскопом. На следующий урок принести бритвенные лезвия, салатный лук.

Курс повышения квалификации

Курс профессиональной переподготовки

Учитель биологии

Курс профессиональной переподготовки

Учитель биологии и химии

Найдите материал к любому уроку,
указав свой предмет (категорию), класс, учебник и тему:

Выберите категорию: Все категорииАлгебраАнглийский языкАстрономияБиологияВнеурочная деятельностьВсеобщая историяГеографияГеометрияДиректору, завучуДоп. образованиеДошкольное образованиеЕстествознаниеИЗО, МХКИностранные языкиИнформатикаИстория РоссииКлассному руководителюКоррекционное обучениеЛитератураЛитературное чтениеЛогопедия, ДефектологияМатематикаМузыкаНачальные классыНемецкий языкОБЖОбществознаниеОкружающий мирПриродоведениеРелигиоведениеРодная литератураРодной языкРусский языкСоциальному педагогуТехнологияУкраинский языкФизикаФизическая культураФилософияФранцузский языкХимияЧерчениеШкольному психологуЭкологияДругое

Выберите класс: Все классыДошкольники1 класс2 класс3 класс4 класс5 класс6 класс7 класс8 класс9 класс10 класс11 класс

Выберите учебник: Все учебники

Выберите тему: Все темы

также Вы можете выбрать тип материала:

Проверен экспертом

Общая информация

Номер материала: ДБ-1079190

Похожие материалы

Вам будут интересны эти курсы:

Оставьте свой комментарий

Устройство светового микроскопа и техника микроскоп и ро ван ия

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Учебно-методическое объединение по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России

ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет Росздрава

ОСНОВЫ ЦИТОГЕНЕТИКИ

Учебное пособие

Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов медицинских вузов

Издательство Саратовского медицинского университета

2008

УДК 57(07)

Настоящее пособие предназначено для самостоятельной вне­аудиторной и аудиторной работы студентов I курса лечебного, педиатрического, медико-профилактического, стоматологического факультетов при изучении раздела «Программы по биологии» (Москва, ГОУ ВУНМЦ, 2001) «Клеточный и молекулярно-генетический уровни организации жизни».

Составители: доктор биол. наук, проф. СИ. Белянина;

доктор биол. наук, проф. И.В. Сергеева; доктор биол. наук, доц. Н.В. Полуконова; канд. биол. наук, доц. Т.А. Андронова; канд. биол. наук, доц. Л.А. Боброва; канд. биол. наук, доц. НА. Дурнова; канд. биол. наук, доц. Л.Е. Сигарева; канд. биол. наук, ст. пред. Ю.В. Белоногова;

Рецензенты: доктор мед. наук, проф. СА. Степанов;

канд. биол. наук, доц. Т.А. Алаторцева.

Рекомендовано к печати ЦКМС СГМУ.

ISBN 5-7213-0259-3 © Составители: СИ. Белянина,

И.В. Сергеева, Н.В. Полуконова, Т.А. Андронова, Л.А. Боброва, НА. Дурнова, Л.Е. Сигарева, Ю.В. Белоногова.

О Саратовский государственный медицинский университет, 2008

Цель занятия: Знать

• Строение светового микроскопа.

• Правила работы с микроскопом при малом и большом уве­личении объективов.

Уметь изготавливать временные препараты различных биологических объектов. Ознакомиться с методами изучения клеток.

Аудиторная работа

Выполнение заданий по данной и последующим темам фиксируется в тетради. Сначала необходимо написать тему занятия, затем — название задания и оформить его выполнение: или зарисовать биологический объект, обозначив изучаемые компоненты, или заполнить таблицу, или ответить письменно на вопросы задания и т.д. Выполненная в аудитории работа подписывается преподавателем.

Задание 1. Методы изучения клеток

Для исследования клеток используют, в первую очередь, микроскопическую технику в виде световой, фазовокон-трастной, люминесцентной и электронной микроскопии. Элек­тронная микроскопия применяется в сочетании с техникой ультратонких срезов. Сканирующие (растровые) электронные микроскопы позволяют получать трехмерное изображение клеток.

Клетки изучают также с помощью цитохимических, био­химических, генетических и иммунологических методов в со­четании с культивированием клеток на искусственных пита-

-з­

тельных средах. Используются: авторадиография — введение в клетки радиоактивных изотопов и обнаружение их затем на фотоэмульсиях; цитоспектрофотометрия; рентгеноструктурный анализ; хроматография; электрофорез. Клеточные компоненты выделяются посредством дифференциального центрифугирования.

Задание 2. Строение светового микроскопа

При световой микроскопии биологических объектов в ка­честве источника освещения используется искусственный или естественный свет. Световая микроскопия позволяет изучать общий план строения основных компонентов и органелл клетки. Максимальное увеличение светового микроскопа -1500 раз.

Основными системами светового микроскопа являются оптическая, осветительная и механическая (рис. 1).

К механической системе, которая служит для управления осветительной и оптической системами, относятся основание, тубус, тубусодержатель, предметный столик, револьвер с от­верстиями для объективов, макро- и микрометрический винты.

Осветительная система предназначена для направления световых лучей на рассматриваемый объект. В нее входят зер­кало, конденсор с диафрагмой и откидной линзой. Зеркало служит для концентрирования и направления светового пучка в объектив. Конденсор с диафрагмой представляет собой сис­тему линз, позволяющую добиться различной степени кон­центрации световых лучей.

Оптическая система включает окуляры и объективы, сос­тоящие из линз. Назначение оптической системы — увеличение изображения рассматриваемого объекта. На оправе окуляра и объектива имеются цифры, показывающие степень увели­чения. Для выяснения разрешающей способности (увеличения)

микроскопа перемножают цифры, стоящие на окуляре и объек­тиве. Микроскоп дает плоское, перевернутое, увеличенное изо­бражение.

Найдите на микроскопе все части механической, осве­тительной и оптической систем и запомните их назначение. Проверьте свои знания по тестам.

Задание 3. Работа со световым микроскопом при малом увеличении объектива

Изучите правила работы с микроскоп

Устройство увеличительных приборов

Строение светового микроскопа

Чтобы ознакомиться со строением клетки и рассмотреть её составные части, нужно использовать увеличительное оборудование, одним из которых является световой микроскоп.

Первые микроскопы были похожи на увеличительные стёкла, и в них использовалось только одно стекло или линза из полированного горного хрусталя.

Одним из первых создателей (1610 г.) микроскопа считают физика и математика Галилео Галилея.

Большие технические возможности и лучшее качество изображения можно получить при помощи микроскопа с двумя линзами. Создание такого прибора связано с именем английского физика Роберта Гука (1665 г.). Этот микроскоп увеличивал в 30 раз.

Для своего времени превосходного мастерства в изготовлении микроскопов достиг нидерландский купец Антони ван Левенгук ( 1632 – 1723 ). Он умел производить линзы, увеличивающие в 200 – 270 раз. Линзы закреплялись на специальном штативе, так как, чтобы достичь такого увеличения, важно, чтобы исследуемый объект находился точно напротив линзы и на определённом расстоянии от неё. За свою жизнь Левенгук изготовил более 200 микроскопов.

Строение современного светового микроскопа

Корпус микроскопа образуют основание и штатив.

К штативу прикреплён предметный столик и присоединён тубус.

В верхней части тубуса расположен окуляр, через который рассматривают изучаемый объект, в нижней части тубуса микроскопа расположены объективы.

Рассматриваемый объект прикрепляется к предметному столику при помощи зажимов.

Важной составной частью микроскопа является источник света.

Освещённость регулируется при помощи диафрагмы.

Для перемещения предметного столика предусмотрены макровинт и микровинт.

Как узнать увеличение микроскопа?

Для увеличения изображения в микроскопе используются 2 линзы (увеличительных стекла). Одна из них находится в объективе, а другая — в окуляре.

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения линзы окуляра на увеличение линзы объектива: Увеличение = окуляр х объектив.

Например, у микроскопа линза увеличивает в 10 раз и окуляр увеличивает в 10 раз. Каково увеличение микроскопа?

Увеличение = окуляр х объектив = 10 х 10 = 100 раз.

В школе обычно используются микроскопы с увеличением до 400 раз.

Работа с микроскопом

Чтобы успешно работать с микроскопом, необходимо соблюдать порядок работы.

1. Включить свет.
2. На предметный столик поместить препарат так, чтобы луч света просвечивал его, и прикрепить зажимами.
3. Смотря в микроскоп, макровинт поворачивать в сторону от себя, чтобы предметный столик отдалялся от объектива, пока не появится чёткое изображение предмета (Если вращать винт в противоположном направлении, то можно повредить препарат или объектив).
4. Рассматривая на малом увеличении (увеличение объектива 4х ), найти место, где образец является наиболее тонким, т. е. где клетки расположены в один слой.
5. Поставить большее увеличение объектива ( 10x ) и рассмотреть препарат. Чёткость изображения настраивается микровинтом.
6. Поставить большее увеличение объектива ( 40x ), рассмотреть препарат и зарисовать его.
7. После просмотра убрать препарат. Микроскоп поставить малым объективом вниз, выключить свет.

Рисуя препарат, надо соблюдать требования к биологическому рисунку.

Увеличение микроскопа 400 раз (400х)

1. Цитоплазма
2. Хлоропласты
3. Ядро
4. Вакуоль
5. Клеточная стенка.

• У рисунка есть название.
• Указано используемое увеличение.
• На рисунке показана форма клетки, форма составных частей, размеры соответствуют видимым в микроскоп.
• На рисунке есть обозначения.
• Длина клетки на рисунке равна хотя бы 3 см.

Рассмотри рисунок светового микроскопа.

Штатив иногда выполняет роль ручки при перемещении микроскопа.
Ответ: C.

Ответ: D.

Какая составная часть микроскопа обозначена буквой I?
Источник света — лампа
Основание
Это предметный столик

Источником света обычно является лампа. В старых микроскопах вместо неё может быть зеркало, при помощи которого можно фокусировать дневной свет из окна или свет другого источника.
Ответ: источник света — лампа.

Какая составная часть микроскопа обозначена буквой E?
Окуляр
Зажимы
Основание

Ответ: зажимы.

Даны увеличения окуляра и объектива микроскопа. Напиши в окошке общее увеличение микроскопа.

Расположи этапы исследования препарата в правильной последовательности (в окошки вписывай заглавные буквы латинского алфавита).

A Отрегулируй резкость микровинтом.
B Смотри в окуляр и поворачивай макровинт так, чтобы предметный столик отдалился от объектива.
C Помести препарат на предметный столик микроскопа.
D Замени объектив с небольшим увеличением на больший, повернув его в сторону.

C -> B -> D -> A

Кто усовершенствовал световой микроскоп?
Чарльз Дарвин
Антони ван Левенгук
Микеланжело

Одним из тех, кто усовершенствовал световой микроскоп, был Антони ван Левенгук, который изготовил более 200 микроскопов.

12 методов в картинках: микроскопия

Один из старейших научных приборов — микроскоп — появился практически одновременно с наукой в ее современном виде. Этот канонический инструмент биолога более 400 лет был важнейшим средством для познания живого, и дал львиную долю наших знаний об устройстве жизни. Все это время эволюция микроскопа продолжалась, расширяя возможности увидеть неразличимое глазом.

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

История микроскопии

На пороге микромира

Собирающие (увеличивающие) линзы были известны с XI века, и очки распространились по Европе уже в XIV веке. Традиционно изобретение первого составного микроскопа приписывают отцу и сыну — Хансу и Захарию Янсенам в 1595 году (рис. 1). Этот первый микроскоп мог увеличивать изображение всего в 3–9 раз. Есть версия, что первый микроскоп создал Корнелиус Дреббель. Среди изобретателей первых микроскопов был и Галилей, создавший свой микроскоп в 1609 году. Так или иначе, ни один из изобретателей не оставил подробных описаний микромира. Микроскопия как наука началась с Роберта Гука, который в 1665 году издал Micrographia — книгу, в которой подробно описывались устройство микроскопа, основы оптики и первые наблюдения за биологическими объектами, иллюстрированные подробными рисунками [1]. Микроскоп Гука (рис. 2) состоял из трех линз и источника света — эта основа сохраняется и в современной микроскопии. Однако достичь больших увеличений удалось с помощью более простой конструкции — Антони ван Левенгук использовал, казалось бы, примитивный микроскоп всего с одной линзой (рис. 2). Однако благодаря высочайшему качеству этой линзы ему удалось достичь 200-кратного увеличения и описать клетки простейших и даже крупные бактерии. Использование всего одной линзы не создавало оптических аберраций, которые только множились при конструировании более сложной оптической системы.

Генеральный партнер цикла «12 методов» — компания «Диаэм»

«Диаэм» — крупнейшая российская компания, специализирующаяся на поставке оборудования и реагентов ведущих мировых производителей в области микроскопии: от микроскопов начального уровня до исследовательских, конфокальных и мультифотонных систем, а также автоматизированных биоимиджинговых систем, способных поддерживать жизнеспособность клеток при постановке длительных экспериментов.

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Рисунок 1. Микроскопия: этапы большого пути. 1590 г. — Захарий и Ханс Янсены создают первый микроскоп. 1665 г. — первое издание книги Роберта Гука Micrographia: описание и иллюстрации первых микроскопических исследований. 1674 г. — Антони ван Левенгук с помощью своего микроскопа описывает инфузории, а в дальнейшем — бактерии, сперматозоиды, вакуоли внутри клетки и т.п. 1858 г. — Йозеф фон Герлах разрабатывает окрашивание кармином — одной из первых гистологических красок. 1878 г. — Эрнст Аббе выводит формулу Аббе, позволяющую вычислить максимальное разрешение, исходя из длины волны. 1911 г. — Оскар Хеймштадт изобретает первый флуоресцентный микроскоп. 1929 г. — Филипп Эллингер и Август Хирт конструируют эпифлуоресцентный микроскоп, в котором эффективно отфильтровывалось излучение от источника света. 1932 г. — Фриц Цернике изобретает фазовый контраст, позволяя рассматривать живые неокрашенные объекты с большим контрастом. 1933 г. — Эрнст Руска совместно с Максом Кноллем создает первый электронный микроскоп. В 1939 году с его помощью выпустили первый коммерческий электронный микроскоп. 1934 г. — Джон Маррак получает первый конъюгат антитела с красителем. Первое практическое использование Альбертом Кунсом, усовершенствовавшим технику конъюгацией с флуоресцентной меткой. 1942 г. — Эрнст Руска создает сканирующий электронный микроскоп. 1962 г. — первое описание GFP Осамой Симомурой. 1967 г. — первое использование конфокальной микроскопии Моймиром Петраном, Дэвидом Эггером и Робертом Галамбосом. 1969 и 1971 гг. — первое описание конфокальной лазерной микроскопии. 1981 г. — Герд Бинниг и Генрих Рорер создают первый сканирующий туннельный микроскоп. 1986 г. — Герд Бинниг, Келвин Куэйт и Кристофер Гербер изобретают атомно-силовую микроскопию. 1990 г. — Винфрид Денки и Джеймс Стиклер разрабатывают первый двухфотонный микроскоп. 1994 г. — Штефан Хелл: суперразрешающая электронная микроскопия на основе подавления спонтанного испускания (STED). 2006 г. — изобретение PALM/STROM-микроскопии. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Рисунок 2а. Первые «ласточки». Микроскоп Гука (реконструкция).

Рисунок 2б. Первые «ласточки». Микроскоп Левенгука.

Улучшение оптики и преодоление аберраций

Оптические артефакты — аберрации — не позволяли рассматривать мелкие объекты, даже когда удавалось достичь больших увеличений. В XVIII веке некоторые мастера-оптики смогли устранить хроматические и сферические аберрации с помощью сложных оптических систем, состоящих из собирающей и рассеивающей линз из разного типа стекол с разными показателями преломления. Ахроматические линзы (то есть линзы, устраняющие хроматические аберрации) изобрел Честер Мур Халл в 1733 году. Первые ахроматические объективы для микроскопов создал Бенджамин Мартин (около 1775 г.) и значительно улучшил Йозеф Фраунгофер. Отец известного хирурга и отца антисептики Джозефа Листера — Джозеф Джексон Листер — обнаружил, что сочетание нескольких ахроматических линз позволяет исправить не только хроматические, но и сферические аберрации (1826 г.). Правда, несмотря на совершенство оптики, повышать увеличение до бесконечности нельзя: причиной тому дифракционный предел, о котором пойдет речь ниже.

Гистология

Рисунок 3. Гистология — дело тонкое: микротом нарезает препарат на слои, прозрачные для микроскопа.

Развитие оптики в XVIII веке позволяло исследовать микромир на больших увеличениях, однако исследование тканей и клеток было сопряжено со множеством трудностей — они же в основном не окрашены, малоконтрастны и быстро умирают вне организма. Очередной прорыв в микроскопии пришел со стороны химии. В XIX веке открыли огромное количество красителей, и биологи пробовали окрашивать ими объекты своих исследований. Одновременно изобрели микротом (рис. 3) — прибор для нарезания тонких срезов тканей определенной толщины. Для стабилизации структуры ткани выдерживали в растворах фиксаторов (например, формалина), после чего препараты хранились долгое время. Для удобства нарезания заформалиненные куски органов заключали в парафин, блоки которого удобно резать.

Ряд классических гистологических красителей, изобретенных в 19-м веке и начале 20-го, используется до сих пор: фиолетовый гематоксилин окрашивает ядра, розовый эозин — цитоплазму клеток, краситель Перлса — двухвалентное железо, реактив Шиффа — полисахариды, краситель Судан III выявляет жиры техникой Дадди, а нитрат серебра — клетки Пуркинье на срезах мозга по методу Рамон-и-Кахаля. Изобретение различных техник позволило описать тонкие структуры каждого органа, выявить входящие в них ткани и даже рассмотреть структуру клеток — ядро (с митотическими хромосомами), ядрышки и митохондрии. Микроскопические исследования того времени, хотя и были в большей степени описательными, сформировали базовые теории клеточной биологии, нейробиологии и иммунологии [2].

Математический аппарат

Дальнейшие улучшения в оптике сопровождались разработкой математического аппарата для ее описания. Джордж Биддель Эйри описал диск Эйри — дифракционный рисунок, образующийся в идеальной оптической линзе с круговой апертурой. Дифракция света ограничивает минимально возможное разрешение между двумя источниками света, и, соответственно, разрешение в оптической системе (то есть минимальное расстояние, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки). Эрнст Аббе предложил формулу дифракционного предела в 1873 году [3]. Формула определяет предельное разрешение как:

r = λ/2NA,

где λ — длина волны источника света (от 390 до 700 нм), а NA — числовая апертура объектива, определяемая как:

NA = n×sin(θ),

где n — индекс преломления среды между объективом и препаратом, а θ — апертурный угол между крайними лучами конического светового пучка, попадающего в объектив.

Из формулы видно, что разрешение тем выше (то есть значение r меньше), чем меньше длина волны (синий свет предпочтителен красному) и чем больше числовая апертура и индекс преломления среды. Поэтому для увеличения разрешения микроскопа используют масляные объективы, когда между препаратом и объективом добавляется иммерсионное масло с высоким показателем преломления. Более строгим является критерий Рэлея, в котором предел разрешения определяется как:

R=0,61×λ/NA

Разница с пределом Аббе вызвана отличием в том, как два оптика определяли разрешение между двумя точками (критерий Рэлея строже).

Устройство микроскопа

Рисунок 4. Под увеличительным стеклом: принципиальное устройство микроскопа. Оптический микроскоп создает огромные увеличения с помощью увеличивающих линз объектива и окуляра. Промежуточные линзы устраняют аберрации, а яркий источник света позволяет рассмотреть препарат даже при больших увеличениях.

Принципиальное устройство светового микроскопа мало менялось со времен Аббе, и основные улучшения касались уменьшения аберраций за счет усложнения состава и количества линз. Оптический микроскоп состоит из источника света, объектива и окуляров. Препарат, освещенный светом лампы, должен находиться немного дальше фокуса объектива, что создает увеличенное изображение, которое усиливается и проецируется линзой окуляра и хрусталиком глаза на сетчатку (или на матрицу камеры). В микроскопах с «бесконечной» оптикой (не ограниченной определенной длиной тубуса) препарат находится в фокусе объектива, и для построения промежуточного изображения необходима дополнительная тубулярная линза. В современных микроскопах каждый из этих компонентов включает в себя большое количество сложных линз для коррекции хроматических и сферических аберраций, а также диафрагмы, позволяющие регулировать размер поля зрения и интенсивность света. Исследовательские микроскопы оснащены несколькими объективами с разным увеличением (от 2,5—4× до 100×), которые имеют одинаковую фокусную длину и могут свободно меняться с помощью револьверной насадки. Таким образом можно найти интересный участок препарата, используя небольшое увеличение, позволяющее рассмотреть широкое поле зрение, и затем разглядеть подробности, сменив объектив на более мощный.

Рисунок 5а. Микроскопические изображения окрашенных срезов тканей. Эластичный хрящ уха (окраска: гематоксилин-эозин).

Рисунок 5б. Микроскопические изображения окрашенных срезов тканей. Срез придатка яичка (окраска: гематоксилин-эозин).

Рисунок 5в. Микроскопические изображения окрашенных срезов тканей. Толстая кишка крысы (пентахромная окраска по Мовату).

Линза окуляра дополнительно увеличивают промежуточное изображение в 10–25 раз, создавая огромные увеличения. Световая микроскопия позволяет хорошо рассмотреть тонкие препараты (например, срезы ткани или клетки, растущие на стекле), окрашенные цветными красителями (например, антителами с цветной меткой или гистологическими красителями) (рис. 5). Окраска препарата требует его химической фиксации, что не подходит для наблюдения за живыми объектами, а поэтому в большинстве современных микроскопов вводят дополнительные элементы, позволяющие наблюдать микроскопические объекты без фиксации — с помощью методов фазового контраста и его модификаций.

Фазовый контраст, видеомикроскопия и клеточные культуры

В то время как световая микроскопия подошла к своему физическому пределу, возникло два новых типа микроскопии, значительно расширяющих возможности метода. Одной из таких модификаций стал фазовый контраст.

Статичность классической гистологии не позволяла наблюдать процессы, происходящие в клетках, в реальном времени. Уже в 19 веке начались первые попытки наблюдать за тканями вне организма. Используя растворы соли и кровь или сыворотку животных, исследователи могли некоторое время поддерживать ткани в живом состоянии вне организма. В 1907 году Росс Гаррисон наблюдал развитие нервных волокон в течение недели. Использование асептических условий, протеолитических ферментов и культуральных сред позволяло выращивать отдельные клетки в течение долгого времени, проводить с ними эксперименты и, конечно, наблюдать с помощью микроскопа. В том же 1907 году Джулиус Риес снял первый микроскопический фильм — развитие эмбриона морского ежа (рис. 6) [4]. В 1913 и 1914 годах Жан Командон и Жустин Жолли снимали деление клеток в клеточной культуре. Изобретение фазового контраста Фрицем Цернике в 1941 году позволило наблюдать неокрашенные биологические объекты — прежде всего живые клетки в культуре. Фазовый контраст и его вариация — дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия (оптика Номарского) — стали основой как для рутинного наблюдения за клеточной культурой, так и для изучения клеточной подвижности и динамики движения органелл.

— Введение

Современные составные микроскопы предназначены для получения увеличенного двухмерного изображения, которое может быть сфокусировано в осевом направлении в последовательных фокальных плоскостях, что позволяет тщательно исследовать мелкие структурные детали образца как в двух, так и в трех измерениях.

Большинство микроскопов имеют механизм трансляции, прикрепленный к столику, который позволяет микроскописту точно позиционировать, ориентировать и фокусировать образец для оптимизации визуализации и записи изображений.Интенсивность освещения и ориентацию световых путей по всему микроскопу можно контролировать с помощью стратегически расположенных диафрагм, зеркал, призм, светоделителей и других оптических элементов для достижения желаемой степени яркости и контраста в образце.

На рисунке 1 представлен типичный микроскоп, оснащенный тринокулярной головкой и 35-миллиметровой камерой для записи микрофотографий. Освещение обеспечивается вольфрамово-галогенной лампой, расположенной в светильнике, которая излучает свет, который сначала проходит через линзу коллектора, а затем попадает в оптический канал в основании микроскопа.В основании микроскопа также размещен ряд фильтров, которые кондиционируют свет, излучаемый лампой накаливания, перед тем, как он отражается зеркалом и проходит через полевую диафрагму в конденсор подэтапа. Конденсор образует световой конус, который омывает образец, расположенный на предметном столике микроскопа, а затем попадает в объектив. Свет, выходящий из объектива, отводится комбинацией светоделителя / призмы либо в окуляры для формирования виртуального изображения, либо прямо через проекционный объектив, установленный в удлинительном тринокулярном тубусе, где он затем может формировать скрытое изображение на пленке, размещенной в камере. система.

Оптические компоненты современных микроскопов смонтированы на устойчивой, эргономичной основе, которая обеспечивает быструю замену, точное центрирование и тщательное выравнивание между оптически взаимозависимыми узлами. Вместе оптические и механические компоненты микроскопа, включая установленный на стеклянном микропрепарате и покровном стекле образец, образуют оптическую цепочку с центральной осью, которая пересекает основание микроскопа и подставку. Оптическая система микроскопа обычно состоит из осветителя (включая источник света и коллекторную линзу), конденсора подэтапа, образца, объектива, окуляра и детектора, который представляет собой камеру или глаз наблюдателя (таблица 1).Микроскопы исследовательского уровня также содержат одно из нескольких устройств кондиционирования света, которые часто располагаются между осветителем и конденсором, и дополнительный детектор или фильтрующее устройство, которое вставляется между объективом и окуляром или камерой. Устройство (а) кондиционирования и детектор работают вместе, чтобы изменять контраст изображения в зависимости от пространственной частоты, фазы, поляризации, поглощения, флуоресценции, внеосевого освещения и / или других свойств образца и техники освещения.Даже без добавления специальных устройств для кондиционирования освещения и фильтрации волн, формирующих изображение, некоторая степень естественной фильтрации происходит даже с самой базовой конфигурацией микроскопа.

Компоненты оптической системы микроскопа

Таблица 1

В то время как некоторые из оптических компонентов микроскопа действуют как формирующие изображение элементы, другие служат для различных модификаций освещения образца, а также имеют функции фильтрации или преобразования.Компонентами, участвующими в формировании изображений оптической системой микроскопа, являются линза коллектора (расположенная внутри или рядом с осветителем), конденсор, объектив, окуляр (или окуляр) и преломляющие элементы человеческого глаза или линзы камеры. Хотя некоторые из этих компонентов обычно не считаются компонентами изображения, их свойства изображения имеют первостепенное значение при определении окончательного качества изображения микроскопа.

Основой для понимания формирования изображения в микроскопе является действие отдельных элементов линзы, составляющих компоненты оптической системы.Самый простой элемент формирования изображения — это идеальная линза (рис. 2), которая представляет собой идеально скорректированный стеклянный элемент, не имеющий аберраций и фокусирующий свет в одной точке. Параллельный параксиальный луч света проходит через собирающую линзу и фокусируется за счет преломления в точечный источник, расположенный в фокальной точке линзы (точка, обозначенная Focus на рисунке 2). Такие линзы часто называют положительными линзами , потому что они заставляют сходящийся световой луч быстрее сходиться или заставляют расходящийся световой луч расходиться менее быстро.Точечный источник света, расположенный в фокальной точке линзы, выходит из линзы как параксиальный параллельный луч света, движущийся справа налево на рисунке 2. Расстояние между линзой и фокальной точкой обозначается как . фокусное расстояние объектива (обозначено расстоянием f на рисунке 2).

Оптические явления часто объясняются либо с точки зрения квантовой теории, либо с точки зрения волновой механики, в зависимости от конкретной описываемой проблемы. При рассмотрении действия линз волнообразные свойства часто можно игнорировать, и считается, что свет распространяется по прямым линиям, часто называемым лучами .Простых диаграмм луча достаточно, чтобы объяснить многие важные аспекты микроскопии, включая рефракцию, фокусное расстояние, увеличение, формирование изображения и диафрагмы. В других случаях удобно называть световые волны состоящими из дискретных частиц ( квантов ), особенно когда свет генерируется квантово-механическими событиями или преобразуется в другие формы энергии. Это обсуждение будет ограничено моделями оптических линз, использующих параксиальные лучи, которые соответствуют как волновой природе света, так и простым диаграммам лучей, на которых свет распространяется слева направо.Параксиальные световые лучи — это лучи, движущиеся очень близко к оптической оси, что приводит к очень малым углам падения и преломления, которые при измерении в радианах можно рассматривать как равные их синусоидальным значениям.

В параллельном луче света отдельные монохроматические световые волны образуют волновую цепочку , имеющую комбинацию электрических и магнитных векторов, колеблющихся в фазе, чтобы сформировать волновой фронт , который имеет ориентацию колебаний, перпендикулярную направлению распространения волны.Плоская волна преобразуется в сферическую волну, когда она проходит через идеальную линзу, с центром в фокусной точке ( Focus ) линзы (Рисунок 2). Световые волны достигают фокусной точки синхронно и в этом месте конструктивно интерферируют друг с другом. В качестве альтернативы, свет, состоящий из сферического волнового фронта, исходящего из фокуса идеальной линзы, преобразуется линзой в плоскую волну (проходящую справа налево на рисунке 2). Каждый световой луч в плоской волне претерпевает различное изменение направления при встрече с линзой, поскольку он достигает поверхности под немного другим углом падения.При выходе из линзы направление светового луча также меняется. В реальных системах угол преломления и фокус линзы или группы линз зависят от толщины, геометрии, показателя преломления и дисперсии каждого компонента в системе.

Характеристики идеальной линзы

Узнайте, как световые волны распространяются через линзу без аберраций и фокусируются в одной точке за счет преломления на изогнутых поверхностях.

Общее действие идеальной линзы (или системы линз) заключается в преобразовании одной сферической волны в другую, при этом геометрические свойства линзы определяют положение фокальной точки.По мере увеличения расстояния источника света от линзы угол расходящихся световых лучей, попадающих в линзу, уменьшается с соответствующим увеличением радиуса волнового фронта. Если радиус сферической волны, попадающей в линзу, бесконечен, радиус сферической волны, проходящей через линзу, становится равным фокусному расстоянию линзы. Идеальная линза имеет две точки фокусировки, и плоская волна, проходящая через линзу, фокусируется в одной из этих точек, в зависимости от того, входят ли световые лучи с левой или правой стороны линзы.

В ситуациях, когда направление распространения плоской волны не совпадает с оптической осью линзы, фокус сферической волны, создаваемой линзой, также удаляется от оси. На рис. 3 показан случай, когда плоский волновой фронт встречается с идеальной линзой при наклоне под углом ( α ). Центр образовавшейся сферической волны обозначен S и находится на расстоянии δ от осевой фокальной точки (обозначен Focus на рисунке 3), но в той же фокальной плоскости.Значение δ можно выразить как :

δ = f × sin (α)

, где f — фокусное расстояние идеального объектива. С точки зрения геометрической оптики, f — это значение, которое относится к радиусу дуги с центром на S и проходящей через центр линзы, как если бы это была одна преломляющая поверхность.

Альтернативная модель для исследования точечного источника света ( S (1) ), который не лежит в фокальной плоскости линзы, показана на рисунке 4.На этом рисунке идеальная линза разделена на две отдельные линзы (линза (a) и линза (b) ), так что точечный источник света S (1) расположен на расстоянии, равном f (a) (фокусное расстояние) от объектива (a) . Аналогично, точечный источник S (2) расположен на расстоянии f (b) , фокусное расстояние объектива (b) . Прямая линия, соединяющая центры линз (a) и линз (b) , называется оптической осью системы линз.

В системе с двумя линзами (рис. 4) сферический волновой фронт, исходящий из точки источника света S (1) и расположенный на расстоянии δ от оптической оси линзы, преобразуется линзой ( а) в плоскую волну. На выходе из линзы (a) плоская волна наклонена относительно оси линзы на угол α . И δ , и α связаны синусоидальным уравнением, рассмотренным выше, при этом значение для f заменено на f (a) .После прохождения через вторую линзу (, линза (b) ) плоская волна преобразуется обратно в сферическую волну с центром, расположенным на S (2) . В результате идеальный объектив L , равный , объектив (a) + , объектив (b) , фокусирует свет из точки S (1) в точку S (2) , а также выполняет обратное действие путем фокусировки света из точки S (2) в точку S (1) . Фокусные точки, имеющие такое соотношение в системе линз, обычно называются сопряженными точками .

В номенклатуре классической оптики пространство между источником света S (1) и входной поверхностью первой линзы называется пространством объекта , а область между второй выходной поверхностью линзы и точкой S (2) известен как пространство изображений . Все точки, связанные с первичными или вторичными световыми лучами, называются объектами (или образцов в оптической микроскопии), а области, содержащие световые лучи, сконцентрированные за счет преломления от линзы, называются изображениями .Если световые волны пересекаются, изображение будет реальных , тогда как если пересекаются только проецируемые продолжения преломленных световых лучей, система линз формирует виртуальное изображение . Реальное изображение может быть визуализировано при проецировании на экран, захваченном на фотоэмульсии или преобразовании в цифровую матрицу с помощью фотодиодных элементов устройства с зарядовой связью (ПЗС). И наоборот, виртуальное изображение требует помощи другой линзы или системы линз, чтобы ее увидел наблюдатель.

Характеристики идеальной системы с двумя объективами

Узнайте, как точечный источник света, не лежащий в фокальной плоскости линзы, может быть представлен как идеальный объектив с помощью системы, состоящей из двух отдельных линз.

Если точку S (1) на рисунке 4 разложить на серию точек, распределенных по одной и той же фокальной плоскости, то идеальный объектив сфокусирует каждую точку в серии на сопряженную точку в фокальной плоскости S. (2) . В случае, когда набор точек S (1) лежит в плоскости, перпендикулярной оптической оси линзы, тогда соответствующие сопряженные точки в наборе S (2) также будут лежать в плоскости, перпендикулярной оптической оси линзы. ось.Верно и обратное: линза будет фокусировать каждую точку в наборе S (2) на сопряженную точку на плоскости или поверхности набора точек S (1) . Соответствующие плоскости или поверхности этого типа известны как сопряженных плоскостей .

Альтернативный метод представления последовательности распространяющихся световых волн показан на рисунке 5 для наклонной световой волны. Этот метод основан на применении законов геометрической оптики для определения размера и местоположения изображений, формируемых линзой или мультилинзовой системой.Два репрезентативных световых луча, один параксиальный и один, проходящий через центр линзы (главный луч ), — это все, что необходимо для определения параметров визуализации. Во многих учебниках по гауссовой оптике эти световые лучи называются характеристическими лучами , причем главный луч проходит через центр входного и выходного зрачков, линзу и любые апертурные диафрагмы, присутствующие в оптической системе. Часто главный луч не учитывается, а характеристические лучи, проходящие через переднюю и заднюю фокальные точки линзы, используются для определения размера и местоположения объекта и изображения.На рисунке 5 второй характеристический луч показан как пунктирная линия с желтым заполнением, проходящая через переднюю точку фокусировки ( F ‘) линзы.

Образец или источник света обозначен на Рисунке 5 S (1) и расположен на расстоянии a слева от линзы в области, известной как пространство объекта. Одиночный световой луч, обозначенный пунктирной линией, исходящий из S (1) и пересекающий оптическую ось в точке фокуса на стороне объекта ( F ‘), преломляется обеими поверхностями линзы и выходит параллельно оптическая ось.Расширения преломленного и падающего лучей пересекаются на поверхности внутри линзы, расположенной на расстоянии a от источника ( S (1) ). Эта поверхность известна как первая или основная поверхность на стороне объекта и обозначена P (1) на рисунке 5. Самый верхний световой луч, идущий от S (1) в направлении, параллельном оптическая ось преломляется линзой и проходит через точку фокусировки на стороне изображения ( F ).Расширения преломленного и падающего лучей пересекаются на основной поверхности стороны изображения (обозначенной как P (2) на рисунке 5) внутри линзы и расположены на расстоянии b от точки изображения S (2) . Вблизи оси линзы поверхности P (1) и P (2) аппроксимируют плоские поверхности и известны как главные плоскости линзы. Пересечения этих плоскостей с оптической осью линзы (не показаны) упоминаются как основных точек .Простые выпуклые линзы, демонстрирующие двустороннюю симметрию, имеют основные точки, симметричные поверхности линзы. Более сложные линзы и системы с несколькими линзами часто имеют основные точки, которые совпадают с поверхностью линзы или даже выходят за пределы стеклянных элементов.

Другой набор точек, используемых для определения параметров линзы, — это узловых точек , которые возникают там, где удлинения наклонных световых лучей, проходящих через линзу, пересекают оптическую ось. Узловые точки не показаны на рисунке 5, но будут располагаться очень близко к основным точкам линзы.Таким образом, три пары точек, фокусные точки линзы ( F и F ‘), главные плоскости ( P (1) и P (2) ) и главные узлы лежат на оптических узлах линзы. ось. Если местоположение фокусных точек и либо главных точек, либо узловых точек известно, то геометрическое построение трассировок лучей для выяснения параметров объекта и изображения может быть выполнено без учета преломления световых лучей на каждой поверхности линзы. В результате можно смоделировать любую систему линз, используя только фокальные точки и главные плоскости, нарисовав следы лучей, как если бы они встречались с первой главной плоскостью, перемещались параллельно оптической оси и выходили из второй главной плоскости без преломления.

Построение лучевых диаграмм

Узнайте, как применение геометрической оптики можно использовать для определения размера и местоположения изображений, формируемых линзами или мультилинзовой системой.

Обратите внимание, что расстояние a больше, чем переднее фокусное расстояние объектива, f ‘ на рисунке 5. В этих условиях в пространстве изображения на расстоянии формируется перевернутое изображение ( S (2) ). b справа от линзы. Длина b больше, чем заднее фокусное расстояние объектива, f , что связано с расстояниями a и b классическим уравнением объектива :

1 / a + 1 / b = 1 / f

Высота изображения S (2) обозначается величиной h (2) и представляет собой увеличение размера в результате увеличения объекта или образца S (1) расположен в передней части объектива и имеет высоту h (1) .Боковое увеличение , M этой простой линзы (которая приближается к тонкой линзе Гаусса) выражается уравнением :

M = h (2) / h (1) = b / a

Потому что S (1) и S (2) лежат в сопряженных плоскостях, изображение S (2) будет сфокусировано линзой на S (1) . Тогда фокусное расстояние будет представлено как f ‘, а увеличение ( M ) инвертировано на 1 / M из-за уменьшения размера изображения, когда рассматривается обратная ситуация.

Отношение расстояний между двумя точками изображения вдоль оптической оси на стороне объекта линзы и двумя сопряженными точками на стороне изображения известно как продольное или осевое увеличение . Величина продольного увеличения равна квадрату бокового увеличения для малых расстояний от плоскости изображения.

Все компоненты оптического микроскопа, формирующие изображения, подчиняются основным геометрическим соотношениям, описанным выше.Сюда входят коллекторный объектив, конденсор, объектив, окуляры (в режиме проецирования), система камеры и человеческий глаз.

Первой ступенью оптической системы микроскопа является фонарный столб, который содержит лампу и коллекторную линзу и отвечает за создание условий первичного освещения для микроскопа. На рисунке 6 представлена ​​схематическая диаграмма типичной конфигурации лампы и коллекторной линзы. Размеры и положение изображения представлены в соответствии с условными обозначениями, представленными на Рисунке 5 для базовой системы линз.Свет, излучаемый вольфрамово-галогенной лампой, проходит через систему коллекторных линз, а нить накала фокусируется на передней фокальной плоскости конденсора. Первая плоскость изображения в оптической системе микроскопа ( Image Plane (1) ) находится в положении полевой диафрагмы.

Плоскости изображения конденсора

Изучите взаимосвязь между плоскостями изображения, относящимися к диафрагмам поля и конденсора, и как размер апертуры влияет на пути следования лучей.

Точка S (1) на нити накала лампы сопряжена с точкой S (2) , которая отображается в фокальной плоскости апертурной диафрагмы конденсора, когда микроскоп настроен для работы в условиях освещения Келлера.Расстояние от S (1) до первой главной плоскости системы коллекторных линз обозначено расстоянием a , а расстояние от ирисовой диафрагмы конденсатора до главной плоскости коллектора со стороны изображения равно расстоянию б . Полевая диафрагма микроскопа (рисунки 6 и 7) определяет диаметр светового луча, излучаемого системой освещения, прежде чем он попадет в апертуру конденсора.

Взаимосвязь между сопряженными плоскостями изображения в конденсорной линзе и системе освещения проиллюстрирована на рисунке 7.Полевая диафрагма (плоскость изображения (1), ) отображается в той же плоскости, что и образец (плоскость изображения (2) ), когда микроскоп настроен для освещения Келлера. Передняя фокальная плоскость конденсора ( F ‘) находится в центре апертурной диафрагмы. Длины a и b представляют собой соответствующие расстояния между полевой диафрагмой (плоскость изображения (1), ) и плоскостью образца (плоскость изображения (2), ) от главных плоскостей элементов линзы конденсора.Свет, излучаемый лампой и проходящий через конденсатор, образует световой конус, который омывает образец и затем проходит через него. Регулировка размера отверстия ирисовой диафрагмы апертуры конденсора регулирует числовую апертуру этого светового конуса.

Плоскости изображения объектива представлены на рисунке 8, который иллюстрирует типичную внутреннюю линзовую систему объектива, плоскость образца (плоскость изображения (2), ) и относительное положение промежуточного изображения микроскопа (плоскость изображения (3 ) ).Плоскость образца сопряжена с промежуточной плоскостью изображения, и каждая из них отделена от главных плоскостей объектива расстояниями a и b соответственно. Передняя точка фокусировки объектива обозначена F ‘, а задняя точка фокусировки, которая находится в плоскости задней апертуры объектива, обозначена как F . Внутренние элементы линз часто представляют собой сложные сборки, состоящие из полусферических и менисковых линз, двойных и тройных линз, а также одиночных линзовых элементов различной конструкции.

Окуляр (или окуляр) предназначен для проецирования реального или виртуального изображения, в зависимости от сложной взаимосвязи между промежуточной плоскостью изображения, фокальными плоскостями окуляра и внутренней полевой диафрагмой окуляра. Кроме того, диаметр фиксированной диафрагмы окуляра также определяет размер линейного поля, наблюдаемого микроскопистом. Это значение называется номером поля или номером поля зрения (сокращенно FN ) и часто наносится на внешнюю поверхность корпуса окуляра.

Плоскости изображения окуляра при использовании в режиме проецирования представлены на рисунке 9. Основными точками фокусировки являются F ‘ и F , передняя и задняя точки фокусировки, соответственно. Промежуточная плоскость изображения ( Image Plane (3) ) расположена в центре фиксированной полевой диафрагмы окуляра, которая размещается либо до, либо после полевой линзы окуляра, в зависимости от конструкции. Эта плоскость изображения сопряжена с плоскостью изображения (4) и является местом, в которое вставляются фокусирующие и измерительные сетки окуляра.Длина a представляет собой расстояние от фиксированной диафрагмы окуляра до главной плоскости линз (линзы, ближайшей к глазу наблюдателя), а b — расстояние от линз до плоскости изображения (4) , расположенной на поверхности датчика. Поскольку a больше, чем переднее фокусное расстояние линз ( f ‘), изображение, сформированное на плоскости изображения (4) , является реальным (не виртуальным) изображением. Величина f обозначает расстояние от линз до задней фокальной плоскости окуляра ( F ), а также представляет собой заднее фокусное расстояние системы линз окуляра.

Плоскости изображения на видео- и ПЗС-датчике представлены на рисунке 10, который иллюстрирует применение специализированной линзы для позитивной проекции для отображения на этих датчиках. Фокусная точка (F) расположена либо на фотокатоде видеотрубки, либо на поверхности матрицы ПЗС-фотодиодов, в зависимости от геометрии и других параметров детектора. Если проекционная линза расположена после окуляра в оптической цепи, то она сводит виртуальное изображение (расположенное в плоскости изображения (3 ‘), ) на поверхность датчика в плоскости изображения (4) .Эта плоскость изображения расположена на расстоянии b от проекционной линзы, которое равно фокусному расстоянию линзы. Следует отметить, что обычная система пленочной камеры также может быть использована вместо видео или ПЗС-сенсора, и в этом случае плоскость изображения совпадает с плоскостью химической эмульсии, нанесенной на пленочную основу.

Окуляры для просмотра и проецирования

Узнайте, как можно соединить окуляры с человеческим глазом или системой камеры для получения изображений, создаваемых объективом микроскопа.

Когда изображения исследуются в микроскопе, промежуточное изображение (см. Плоскость изображения (3) на рисунке 11) формируется объективом на расстоянии a , которое немного ближе к окуляру, чем его передняя часть. фокусное расстояние ( F ‘). Это предотвращает формирование реального изображения после окулярной линзы, как показано на Рисунке 9 для окуляра, работающего в режиме проецирования. Вместе глаз и окуляр образуют изображение на сетчатке ( Image Plane (4) ), как если бы глаз видел виртуальное изображение.

В ситуациях, когда расстояние a меньше фокусного расстояния, то обратное уравнение, связывающее фокусное расстояние с a и b , показывает, что b должно быть меньше нуля. Следовательно, реальное изображение не формируется справа от окуляра в отсутствие глаза или камеры. Вместо этого виртуальное изображение (плоскость изображения (3 ‘) ) появляется на расстоянии, соответствующем -b (рис. 11) слева от окуляра (или b справа; см. Рис. 5).При наблюдении за изображением через окуляр луч, формирующий изображение, расходящийся через глазки, кажется, исходит от виртуального источника (расположенного в плоскости изображения (3 ‘) ). Световые лучи, выходящие из окуляра, образуют световой конус, который составляет выходной зрачок микроскопа, который также обычно называют точкой глаза или диском Рамсдена . Для правильного наблюдения увеличенных образцов выходной зрачок микроскопа должен совпадать со зрачком глаза наблюдателя.

Плоскости изображения 2, 3, 3 ‘и 4 (рисунки 7-11) связаны друг с другом геометрически, как показано на рисунке 12. На всех этапах визуализации, за исключением плоскости изображения (3′) , изображение реальное и перевернутое (см. рисунки 7-11). Когда окуляр микроскопа используется для прямого просмотра (Рисунок 11), а не для проецирования (Рисунок 9), изображение на Image Plane (3 ‘) не является реальным, а виртуальным и не инвертируется относительно промежуточного изображения. Человеческий глаз не будет воспринимать изображение на сетчатке (плоскость изображения (4), ) как инвертированное, даже если изображение инвертировано относительно промежуточного изображения (плоскость изображения (3) ) и виртуального изображения (расположенного в плоскости изображения (3 ‘) ).

Некоторые из основных плоскостей изображения в микроскопе имеют фиксированную или регулируемую апертуру или диафрагмы, которые являются важными компонентами всех оптических систем. Диафрагма, также называемая упором , представляет собой непрозрачный затвор или оправу для линз с круглым отверстием (часто регулируемым), которое контролирует световой поток через микроскоп. В микроскопе используются два основных типа диафрагм: апертурная диафрагма , которая регулирует апертурные углы в микроскопе, и полевая диафрагма , которая контролирует размер поля, отображаемого прибором.Основная роль диафрагм в оптическом микроскопе — предотвращать попадание световых лучей с сильной аберрацией и рассеянным светом на плоскости изображения, а также обеспечивать подходящее распределение и интенсивность света как в объекте, так и в пространстве изображения.

Классическая конструкция микроскопа основана на двух апертурах и двух диафрагмах для контроля прохождения света через микроскоп. Полевая диафрагма, расположенная в светильнике или в основании микроскопа, представляет собой регулируемую диафрагму ирисового типа, которая определяет размер освещающего поля света.В передней фокальной плоскости конденсора расположена апертура конденсора, еще одна ирисовая диафрагма, которая используется для регулировки размера луча и угла падения световых лучей на образец. Третья апертура имеет фиксированный размер и расположена в задней фокальной плоскости объектива. Эта апертура определяет диаметр выходного зрачка объектива и размер промежуточного изображения, в то время как сопряженная фиксированная диафрагма в окуляре (диафрагма поля окуляра) определяет размер поля зрения, видимого микроскопистом.

Общее увеличение микроскопа можно определить, учитывая свойства объектива и окуляров. Объективы корректируются для определенного расстояния проецирования, которое зависит от увеличения и примерно равно длине оптической трубки. В микроскопе с фиксированной длиной трубки это проекционное расстояние составляет около 160 миллиметров. Следовательно, объектив с фокусным расстоянием 8 мм будет иметь поперечное увеличение примерно 20x (160/8) с соответствующим увеличением в продольном направлении 400x (20×20).

Для визуального наблюдения предполагается, что увеличение окуляра равно единице, если образец (или изображение) находится на расстоянии 250 миллиметров от глаза наблюдателя. В связи с этим окуляр с фокусным расстоянием 25 миллиметров будет иметь значение увеличения 10x (250/25). Общее увеличение микроскопа для визуального наблюдения вычисляется как произведение увеличений объектива и окуляра. Для только что описанных объектива и окуляра общее боковое увеличение будет примерно 200x (10x окуляра, умноженного на 20x).Следует отметить, что большинство современных исследовательских микроскопов оснащены объективами с коррекцией на бесконечность, которые больше не проецируют промежуточное изображение непосредственно в промежуточную плоскость изображения. Вместо этого свет, исходящий от этих объективов, фокусируется на бесконечность, а вторая линза, известная как трубчатая линза , формирует изображение в ее фокальной плоскости. Волновые дорожки света, выходящие из объектива, сфокусированного на бесконечность, коллимируются, что позволяет вводить вспомогательные компоненты, такие как призмы дифференциального интерференционного контраста (ДИК), поляризаторы и эпифлуоресцентные осветители, на параллельный оптический путь между объективом и линзой трубки, всего лишь минимальное влияние на коррекцию фокуса и аберраций.

Увеличение промежуточного изображения в оптических микроскопах с коррекцией на бесконечность определяется соотношением фокусных расстояний линзы тубуса и линзы объектива. Поскольку фокусное расстояние линзы трубки варьируется от 160 до 250 миллиметров (в зависимости от производителя и модели), нельзя больше полагать, что фокусное расстояние объектива составляет 160 миллиметров, разделенных на его увеличение. Таким образом, объектив с фокусным расстоянием 8 миллиметров в микроскопе с коррекцией на бесконечность с фокусным расстоянием линзы трубки 200 миллиметров будет иметь поперечное увеличение 25x (200/8).

У старых микроскопов с конечной или фиксированной длиной тубуса определенное расстояние от отверстия револьвера, где крепится тубус объектива, до окуляра в тубусах окуляра. Это расстояние обозначается как длина механической трубки микроскопа. Конструкция предполагает, что когда образец помещен в фокус, он находится на несколько микрон дальше, чем передняя фокальная плоскость объектива. Конечная длина трубки была стандартизирована до 160 миллиметров в девятнадцатом веке Королевским микроскопическим обществом (RMS) и получила широкое признание на протяжении более 100 лет.Объективы, предназначенные для использования с микроскопом, имеющим длину трубки 160 миллиметров, имеют это значение на корпусе.

Добавление оптических аксессуаров на световой путь микроскопа с фиксированной длиной трубки увеличивает эффективную длину трубки до значения более 160 миллиметров. По этой причине добавление вертикального осветителя отраженного света, поляризационного промежуточного каскада или подобного приспособления может внести сферическую аберрацию в оптическую систему с идеальной коррекцией.В то время, когда большинство микроскопов имели фиксированную длину тубуса, производители были вынуждены помещать в эти аксессуары дополнительные оптические элементы, чтобы восстановить эффективную 160-миллиметровую длину тубуса микроскопической системы. Стоимость этого действия часто заключалась в увеличении увеличения и уменьшении интенсивности света в получаемых изображениях.

Для записи изображений с помощью видеомикроскопа, камеры CCD с фотодиодной матрицей или классической микрофотографии с помощью пленочных камер после окуляра часто устанавливают специализированную позитивную линзу (см. Рисунок 10).Световые лучи, выходящие из окуляра, сфокусированного на бесконечность, сходятся положительной линзой на плоскости фотокатода, матрицы ПЗС или фотоэмульсии. Если пренебречь увеличением линзы объектива, поперечное увеличение проекционной системы ( M (p) ) выражается как :

M (p) = f (p) / f (e)

, где f (p) — фокусное расстояние проекционного объектива, а f (e) — фокусное расстояние окуляра.В этой проекционной системе общее боковое увеличение ( M ) на лицевой панели видеокамеры, матрице фотодиодов CCD или фотоэмульсии составляет :

M = M (o) + M (p)

M = M (o) • M (e) • f (p) / 250 миллиметров

, где M (o) — увеличение объектива, а M (e) — увеличение линзы окуляра. Если за окуляром не используется проекционный объектив, а используется сам окуляр для проецирования изображения на датчик видеоизображения или фотоэмульсию, общее поперечное увеличение становится равным :

M = M (o) • D (p) / f (e)

, где D (p) — расстояние проекции от окуляра до плоскости изображения.Чтобы избежать искажения изображения, для D (p) следует использовать значение от 20 до 30 сантиметров, если не используется специальный окуляр.

Увеличения, указанные производителем на оправе объектива или окуляре, являются номинальными и должны быть откалиброваны с помощью предметного микрометра для получения точного значения. Измерения увеличения выполняются путем размещения предметного столика-микрометра в плоскости образца (на предметном столике микроскопа) и визуализации тонкоструктурных линий в идентичных оптических условиях.

В некоторых случаях датчик камеры размещается непосредственно в промежуточной плоскости изображения, без наличия проекционного окуляра, что приводит к увеличению изображения, ограниченному величиной, создаваемой объективом. Этот метод рекомендуется только тогда, когда производительность видеосистемы ограничена абсолютным количеством доступного света, поскольку такое фиксированное увеличение накладывает серьезные ограничения на возможность оптимизации качества конечного видеоизображения.

Таким образом, пути лучей через микроскопы конечной длины и с поправкой на бесконечность рассмотрены и проиллюстрированы на рисунках 12 и 13.Оптическая система микроскопа с конечной (фиксированной длиной трубки) проиллюстрирована на рисунке 12, который включает в себя основные оптические элементы и трассы лучей, определяющие взаимосвязь между плоскостями изображения. Образец, расположенный на небольшом расстоянии до передней фокальной плоскости объектива, отображается через сопряженные плоскости на сетчатке глаза в плоскости изображения (4) . Линза объектива проецирует реальное перевернутое изображение увеличенного образца на промежуточную плоскость изображения микроскопа ( Image Plane (3) ), которая расположена в центре полевой диафрагмы окуляра на фиксированном расстоянии за объективом.На рисунке 12 задняя фокальная плоскость объектива расположена в месте на оптической оси, обозначенном F ‘(объектив) , а расстояние между этой фокальной плоскостью и промежуточной плоскостью изображения представляет собой длину оптической трубки микроскопа.

Плоскости сопряженного поля бесконечности

В этом учебном пособии исследуются геометрические отношения между плоскостями изображения в оптическом микроскопе, настроенном для коррекции на бесконечность с помощью тубуса.

Промежуточное изображение, полученное с воздуха, дополнительно увеличивается с помощью окуляра микроскопа и дает прямое изображение образца на поверхности сетчатки, которое микроскописту кажется перевернутым.Как обсуждалось выше, коэффициент увеличения образца рассчитывается с учетом расстояния между образцом и объективом, а также переднего фокусного расстояния системы линз объектива ( F (объектив) ). Изображение, полученное в промежуточной плоскости, дополнительно увеличивается в 25 сантиметров (так называемое расстояние до глаза), деленное на фокусное расстояние окуляра. Визуальный образ (виртуальный) кажется наблюдателю так, как если бы он находился на расстоянии 10 дюймов от глаза.

Большинство объективов корректируются для работы в узком диапазоне расстояний до изображения, и многие из них предназначены для работы только в специально скорректированных оптических системах с соответствующими окулярами. Увеличение, указанное на тубусе объектива, определяется длиной трубки микроскопа, для которой он был разработан.

На рис. 13 показана оптическая система микроскопа с коррекцией на бесконечность, использующая следы лучей. Компоненты этой системы обозначены аналогично системе с конечной длиной трубки (Рисунок 12) для облегчения сравнения.Здесь увеличение объектива определяется фокусным расстоянием линзы трубки. Обратите внимание на бесконечное «афокальное» пространство, которое определяется параллельными световыми лучами на каждом азимуте между объективом и линзой трубки. Это пространство, используемое производителями микроскопов для добавления аксессуаров, таких как вертикальные осветители, призмы ДИК, поляризаторы, пластины замедления и т. Д., С гораздо более простой конструкцией и с небольшим искажением изображения. Увеличение объектива в системе с коррекцией на бесконечность равно фокусному расстоянию линзы трубки, деленному на фокусное расстояние объектива.

В оптическом микроскопе сопряженные плоскости отображаются друг в друге, и их можно совместно наблюдать, исследуя образец в окуляры. Эта концепция проиллюстрирована на рис. 14 с изображением окрашенного тонкого среза растительной ткани, наложенного на лепестки радужной оболочки полевой диафрагмы и фокусирующей сетки в промежуточной плоскости изображения окуляра. Полевая ирисовая диафрагма, прилегающая к линзе коллектора лампы, резко отображается в той же плоскости, что и образец, с помощью конденсора микроскопа.Изображения как полевой диафрагмы, так и образца формируются объективом в промежуточной плоскости изображения и проецируются на фиксированную полевую диафрагму окуляра, где расположена фокусирующая сетка. Затем окуляр (вместе с глазом наблюдателя, расположенный в плоскости изображения (4) ) формирует изображения всех трех предыдущих плоскостей изображения на сенсорной поверхности системы формирования изображения или сетчатке человеческого глаза. Полевая диафрагма, образец, промежуточное изображение и сетчатка — все это представляет собой набор сопряженных плоскостей изображения, которые одновременно появляются в фокусе.

Соавторы

Кеннет Р. Спринг — научный консультант, Ласби, Мэриленд, 20657.

Майкл У. Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. , Florida, 32310.

Световые микроскопы с креплением для камеры

Световые микроскопы используются для контроля качества и детального исследования недавно разработанных материалов, электронных устройств, металлов и химикатов.Разработанный с учетом модульности, пользователи могут настраивать свои системы с помощью компонентов оптических и цифровых изображений, необходимых для сегодняшних взыскательных микроскопистов.

Вертикальные металлургические микроскопы Olympus серии BX подходят для широкого спектра аналитических задач, от рутинных проверок до сложных аналитических исследований, благодаря широкому диапазону моделей микроскопов, усиленных превосходными оптическими характеристиками и разнообразием аксессуаров.

Инвертированные металлургические микроскопы Olympus серии GX — это надежная и высокопроизводительная система визуализации с передовой оптикой Olympus UIS2.Микроскопы GX обеспечивают высокую эффективность в сочетании с программным обеспечением Olympus Imaging Analysis.

Модульные микроскопы Olympus BXFM — идеальные оптические модули для интеграции в сложные системы контроля. Широкий выбор компонентов, от ручных до моторизованных, увеличивает гибкость.

Цифровые микроскопы серии DSX

Компания Olympus представила миру новое измерение в промышленной микроскопии с помощью цифровой микроскопической системы серии DSX.Сегодня, благодаря уникальному сочетанию проверенной временем оптики Olympus и новейших технологий цифровой обработки изображений, серия Olympus DSX устанавливает новый стандарт в промышленных микроскопах.

Камера и программное обеспечение

Доступны цифровые камеры, обеспечивающие высокое разрешение и точность цветопередачи. Комплексное решение Olympus связано с усовершенствованным программным обеспечением для обработки изображений, которое обеспечивает интегрированные операции от простого захвата изображения до обработки изображений, измерения и создания отчетов.

Программное обеспечение для анализа изображений OLYMPUS Stream предлагает быстрые и эффективные рабочие процессы проверки для всех этапов процесса получения изображений, количественных измерений и анализа изображений, составления отчетов и задач расширенного контроля материаловедения.

Посмотреть продукт

Цифровые камеры Olympus разработаны исключительно для микроскопов и в наши дни становятся незаменимыми опциями. Все камеры подтверждены лучшими характеристиками цифровой обработки изображений с помощью систем Olympus Microscopes и Imaging Analysis Software.

Просмотреть продукт